【前沿组学】创新AIDSA LCMS策略高覆盖表征不同官能团内源性激素

鸡年吉祥，诸事顺意！年前一期前沿组学给大家分享了基于 LC-MRM 的创新衍生化技术助力内源性代谢物灵敏度近千倍提升及无需标样建立通用质谱方法的研究进展。在靶向代谢组学中，除了灵敏度及标准品需求的瓶颈，不同官能团代谢物的同时检测也会挑战着代谢轮廓的表征。本期将继续为大家分享基于衍生化策略并巧妙利用仪器模块的自动化功能来攻克不同官能团内源性代谢物高覆盖表征的挑战。

采用 AIDSA 策略同时衍生化表征人血清中的羰基和酚羟基甾体激素轮廓的 UHPLC-MS/MS 法

——新型衍生化策略破解靶向代谢组学的挑战（二）

本文分享来自中国医学科学院药物研究所张金兰研究员课题组 2016 年发表在 Analytical Chemistry 上的题为 Ultraperformance Liquid Chromatography−Tandem Mass Spectrometry Method for Profiling Ketolic and Phenolic Sex Steroids Using an Automated Injection Program Combined with Diverter Valve Switch and Step Analysis 的文章。

文章链接：http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.6b02201

内源性甾体激素包括孕激素、雌激素和雄激素，在体内浓度很低，却广泛参与重要的生理、病理过程，因此，对甾体激素的定量检测一直是研究的热点。甾体激素具环戊烷多氢菲结构，母核上通常连有酚羟基和/或羰基两类官能团（图 1），质谱直接分析灵敏度往往达不到生物样本的检测需求；针对酚羟基和羰基分别采用丹磺酰氯和吉拉德 P 衍生化，可大大提高检测灵敏度，但无论哪一种方法都无法实现这两类官能团的同时衍化生，使得全面表征不同类型的甾体激素变得耗时、耗力、耗生物样本量。研究旨在基于超高效液相色谱串联质谱仪（UHPLC-MS/MS）开发一种创新的整合 AIDSA 策略，实现一份样品一次分析即可完成羰基和酚羟基甾体激素的同时衍生化轮廓表征和定量分析。

图 1. (A) 甾体激素的代谢通路。粉色、黄色、蓝色、绿色和白色分别代表只含有羰基、只含有酚羟基、既有羰基又有酚羟基、结合型和无特殊官能团的甾体激素; (B)甾体激素的化学结构

AIDSA (Automated Injection Program Combined with Diverter valve switch and Step Analysis) 流程

研究通过巧妙集成 UHPLC-MS/MS 系统的自动化进样程序、阀切换和分步分析（AIDSA），对一份生物样本中羰基和酚羟基甾体激素进行两次衍生化，按照离线与在线衍生化进行整合，并且实现质谱同时轮廓表征和定量分析，详细流程如图 2 所示。

图 2. AIDSA UHPLC-MS/MS 策略用于羰基和酚羟基甾体激素定量表征的工作流程

（s1）离线衍生羰基类甾体激素

采取液液萃取从生物样本中提取甾体激素，紧接着进行离线的吉拉德 P 衍生化。

（s2）羰基离线衍生样品的上样与酚羟基类甾体激素的在线衍生——利用自动化进样程序

进样程序自动吸取两次样本：第一次将离线吉拉德 P 衍生样品加载到色谱柱；第二次使样品在进样针中完成丹磺酰氯在线衍生化，再加载到色谱柱。

（s3）质谱切换阀与进样程序密切配合导入衍生化的甾体激素并去除多余的衍生化试剂。

（s4）UHPLC-MS/MS 对导入的两类甾体激素衍生产物按进样顺序进行分步分析

采用安捷伦 1290 UHPLC  - 6490 QQQ，为了有效利用丹磺酰氯在线衍生化的等待时间，在线衍生期间即同时对吉拉德P衍生产物进行 UHPLC-MS/MS 分析。整个多反应监测分为 4 个时间段，第一和第三段质谱切换阀设为 to waste，除去多余的衍生化反应试剂避免质谱污染；第二和第四段设为 to source，分步分析羰基和酚羟基类衍生化产物。代表性的 TIC 及 MRM 图谱见图 3。

图 3. 总离子流图（上）和代表性 MRM 图谱 (下，300 pg/mL 的人血清质控样本)

AIDSA UHPLC-MS/MS 策略用于甾体激素靶向代谢组学的研究

采用新开发的方法成功研究了性别和年龄对甾体激素的影响。t 检验发现女性与男性相比，PROG 和 2-OHE1 显著增加，而 TES 显著下降（p < 0.05）；结合 OPLA-DA 分析，发现 TES 可以作为表征性别的潜在生物标志物（图 4 ）。在研究年龄对甾体激素的影响中，发现无论男性还是女性，雄激素和孕激素的含量随着年龄的增加而下降，而雌激素并没有呈现与年龄相关的变化趋势。

图 4. 甾体激素的含量随性别的变化, *, p< 0.05

研究巧妙集成超高效液相色谱串联质谱仪的自动化进样程序、阀切换功能和分步分析（AIDSA）形成整合流程，实现一份样品一次分析即可完成羰基和酚羟基甾体激素的同时衍生化轮廓表征和定量分析，开发了一种省时、省力、省样品量的对不同官能团甾体激素高覆盖的分析策略，该策略可以成功用于生物样品靶向定量代谢组学的研究。本研究的集成整合的创新衍生化分析策略无疑将助力靶向代谢组学研究瓶颈的突破。

参考文献：

C. Wang, C. S Wu, L. Zhang, and J.LZhang, Ultraperformance Liquid Chromatography−Tandem Mass Spectrometry Method for Profiling Ketolic and Phenolic Sex Steroids Using an Automated Injection Program Combined with Diverter Valve Switch and Step Analysis,Analytical Chemistry, 2016, 88, 7878−7884

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