【前沿组学】内源性代谢物灵敏度近千倍提升的创新衍生化 LC-MRM 分析技术

代谢组学从非靶向走向靶向正成为研究趋势，靶向代谢组学针对一类或多类具有潜在生物学意义的目标代谢物进行半定量或定量分析。然而，靶向代谢组学经常会面临如下一些困境：代谢物因自身结构特点检测灵敏度很低不能满足生物样本分析需求，不同种类的代谢物很难同时提取和同时检测，方法的开发和优化需要标准品等等，这些困境给靶向代谢组学的研究带来了极大的挑战。接下来两期将为大家分享来自中国医学科学院药物研究所张金兰研究员课题组基于创新衍生化策略破解靶向代谢组学挑战的研究成果。

创新衍生化策略实现内源性脂肪醛近千倍灵敏度的提升及LC-MRM全面表征

——新型衍生化策略破解靶向代谢组学的挑战（一）

本期分享来自 2016 年发表在 Analytical Chemistry 上的题为 NovelDerivatization Strategy for the Comprehensive Characterization of EndogenousFatty Aldehydes Using HPLC-MRM 的文章。

文章链接：http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.6b01756

脂肪醛是由醛基和脂肪族碳链组成的一类脂质小分子，具有多种重要的生物学功能被广泛关注，但因为脂肪醛结构的不稳定、反相色谱保留困难、离子化效率低等特点，现有方法无论是检测灵敏度还是检测的种类都很难满足生物样品中对其的全面表征。该研究报道了一种基于 UHPLC-MRM 分析的新型脂肪醛衍生化策略带来灵敏度近千倍的提升，建立了生物样本中无对照品对内源性未知脂肪醛类化合物结构定性全面表征和定量分析的策略。

新型衍生化方法的开发及优化

该研究筛选了与脂肪醛具有高反应活性的 T3/D3（T3：2,4-二乙氨基-6-肼基-1,3,5-三嗪；D3：T3 的 20 氘代同位素）作为衍生化试剂，与脂肪醛衍生生成腙类化合物（图 1）。采用同位素稀释法定量， D3 衍生作为 T3 衍生化合物的内标。通过衍生条件的全面优化，本研究最终开发了目前已知最温和和最快速的脂肪醛类衍生化方法，衍生化在 37℃ 反应 15min 即可达到终点，并且衍生化效率大于 98%。

图1. 衍生化机理，红色星标部分的氢原子被氘代后得到重同位素衍生化试剂 D3

建立脂肪醛类UHPLC-MRM全面表征的通用质谱方法-无需标样

该研究有效利用衍生后的脂肪醛类其亚结构的相似性，在相同的碰撞能量下，质谱中均产生一致来源于衍生化试剂的最强子离子，实现无需标样即可建立 MRM 的母子离子对及全面表征的通过分析方法。采用安捷伦 1290 UHPLC - 6490 QQQ 分析，T3 衍生的脂肪醛均一致产生最强的子离子 m/z209，D3 衍生的脂肪醛均一致产生最强的子离子 m/z224（图 2）。

图2. 代表性T3/D3衍生化脂肪醛的二级质谱图

新型衍生化策略对于检测灵敏度的提升

T3/D3 衍生化后极好的增加了脂肪醛的疏水性及色谱保留、改善了分离度并提升了峰形，良好的色谱结果是保证灵敏度的重要前提；此外，衍生化引入的碱性基团，使离子化效率大幅增强。结合质谱检测条件的优化，采用安捷伦1290 UHPLC - 6490 QQQ 分析，相比于之前的文献报告检出限 100pg/mL, 该研究对脂肪醛的检测限可以低至 0.1-1pg/mL，灵敏度实现了近千倍的提升。

未知脂肪醛类的结构定性表征

D3/T3 衍生的脂肪醛互为一对同位素标记/未标记化合物，通过对已知衍生标准品的分析，发现每一对 D3/T3 脂肪醛衍生物之间保留时间的微小偏差、丰度的比例与脂肪醛的结构存在依数性关系，基于此建立了内源性脂肪醛发现和全面表征的数学模型，使用该数学模型一共在大鼠血浆中发现 84 种脂肪醛类化合物。

大鼠脑缺血条件下血浆和脑组织中脂肪醛靶向脂质组分析

该研究采用新建立的脂肪醛全面表征和相对定量分析策略研究了大鼠脑缺血的病理条件下，血浆和脑组织中脂肪醛的变化，结合统计学分析，一共在血浆中发现 43 种显著变化的脂肪醛（P<0.05），在脑组织中发现了 19 种显著变化的脂肪醛（P<0.05）。通过该研究，可以提示研究的关注点不应该仅仅局限在有显著毒理学证据的脂肪醛类化合物（丙二醛、丙烯醛和 4-羟基壬烯醛），而应该对机体中系列脂肪醛类化合物进行全覆盖的深入研究。

图3. 基于对照和脑缺血模型大鼠血浆和脑组织中脂肪醛含量的统计分析结果

该研究建立了采用 T3/D3 衍生化对内源性脂肪醛类化合物进行全面表征的创新策略，衍生化可以在 37℃ 反应 15min 达到终点，衍生化效率大于 98%，衍生化之后的质谱检测灵敏度得到了近千倍的提升，并且所建立的通用 MRM 方法无需标样进行逐一优化。在随后的生物样本分析中，实现了对大于 80 种内源性脂肪醛的同时检测。该研究建立的基于 UHPLC-MRM 的高灵敏度、高效的脂肪醛全面表征的衍生化策略对于破解靶向代谢组的诸多瓶颈提供了有价值的思路和技术策略参考。

参考文献：

T Cai, T Hu, ZX Jia, JL Zhang, Novel DerivatizationStrategy for the Comprehensive Characterization of Endogenous Fatty AldehydesUsing HPLC-MRM, Analytical Chemistry, 2016, 88, 7762−7768. 

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