高通量单细胞RNA代谢标记测序技术的比较与评估

利用高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合代谢标记技术，可以精准测量复杂生物过程中的基因表达动态，如细胞状态转换和胚胎发生。该技术通过诱导碱基转换标记新合成的RNA进行检测，其检测效率取决于转换效率、RNA完整性和灵敏度（每个细胞检测到的基因/转录本），这受到所选化学转化方法和平台兼容性的影响。目前缺乏对化学方法和平台兼容性的全面比较研究。

2025年7月1日

上海海洋大学陈良标/胡鹏团队在Nature Communications （IF=15.7）在线发表题为“Benchmarking metabolic RNA labeling techniques for high-throughput single-cell RNA sequencing”的研究论文，该研究系统评估并优化了单细胞新生RNA测序技术，突破了鱼类胚胎早期合子基因激活解析难题。

该研究首先使用Drop-seq平台对10种化学转化方法进行了系统比较，共计分析了52,529个细胞。研究发现，“on-beads”方法，特别是基于mCPBA/TFEA的组合，优于“in-situ”方法（图一）。研究人员通过系统性比较多种新生转录本标记的化学转化方法与高通量单细胞RNA测序平台组合的兼容性，成功筛选出适用于斑马鱼胚胎早期发育合子基因激活检测的最优组合，并将这些优化的方法应用于19,883个来自斑马鱼5.5 hpf胚胎的细胞，显著提高了早期合子转录本的检测灵敏度，攻克了合子基因检测难题。此外，还评估了两个具有更高捕获效率的商业平台，再次验证了“on-beads”化学转化方法表现最优。总之，该研究为选择最佳化学转化方法和scRNA-seq平台提供了关键指导，推进了复杂生物系统中RNA动力学的研究。

4sU代谢标记涉及几个关键步骤：4sU被掺入到新合成的RNA中，随后进行化学转化反应，并确保与高通量scRNA-seq平台的兼容性。目前已发表的化学转化方法包括SLAM-seq、TimeLapse-seq、TUC-seq等，这些方法建立在不同的scRNA-seq平台上，结合了不同的化学条件。其检测效率通常由T-to-C转换率表示的转化效率，以及每个细胞检测到的基因/转录本表示的灵敏度来决定。尽管有研究通过优化分析方法来提高检测效率，但在实验水平上提高4sU标记和T-to-C转换效率来实现更高的检测效率仍至关重要。

在该研究中，研究人员选取了10种广泛使用的化学转化方法，在Drop-seq单细胞测序平台上，对超过52,529个斑马鱼胚胎成纤维细胞（ZF4）进行了系统性评测，发现基于mCPBA/TFEA的“on-beads”化学转化方法表现最优，其T-to-C替换率超过8%，同时能保持高RNA完整性和转录本回收率，显著优于体内标记的方法“in-situ”。随后，研究团队将筛选出的最优代谢RNA标记化学方法应用于斑马鱼胚胎早期发育的研究，通过在受精卵的单细胞阶段显微注射4-硫尿苷（4sU）来标记新合成的合子转录本。利用优化后的方法，成功实现：

基于on-beads的方法必须在单细胞捕获后、全长cDNA合成前完成T-to-C的碱基转换，而常用的商用微流控平台因流程固化，往往灵活性受限、难以在这一关键节点进行个性化设计和调整，而基于PIP-seq平台的Illumina Single Cell Prep (ISCP)与Drop-Seq类似，通过beads来捕获细胞裂解的mRNA，能更为灵活的处理mRNA进行化学转化。而比较Drop-seq平台而言，具有较高的细胞捕获率。这两个优势恰好为该关键步骤提供了理想的操作窗口。

在近期前期实验中，上海海洋大学胡鹏课题组采用了ISCP T10建库试剂盒，分别评估了On-beads IAA-based与mCPBA-based两种化学转化方法。结果显示，基于PIP-seq的因美纳单细胞平台ISCP，不仅实现了理想的T-to-C转化率，还能以≥70%的稳定效率捕获细胞，并维持较高的文库复杂度。

此外，ISCP工作流程易于实施，无需昂贵的微流控设备，广泛兼容、制备快速、通量灵活的特点使ISCP能够帮助任何规模的实验和实验室进行大规模、多样化的单细胞测序研究，尤其是针对超大细胞数目、相对更大尺寸的细胞和离体容易凋亡的细胞具备良好的兼容性，为多样化的单细胞测序场景提供了更高效、经济、稳定的解决方案，更多资料扫描文末二维码进一步了解。