Nature Commun最新，Spectronaut软件针对pSILAC数据分析的具体操作逻辑

 启动directDIA分析，选择质谱数据文件（支持.d或.raw格式）。

选择对应的蛋白序列数据库（FASTA文件）

同位素标记设置：在Labeling标签中明确指定标记类型，如Channel 1为无标记，Channel 2为Arg10、Lys8

缺失通道生成(In-Silico Generate Missing Channels)：在Workflow标签中启用此选项

碎片离子过滤(Fragment ion filtering)：在Result Filters标签中选择Overlapping between Channels时，共享的碎片离子完全排除用于鉴定与定量；若未勾选则共享碎片仅在定量时排除（鉴定是保留的）。此选项对后续特定通道FDR过滤（如Min Q-value和Max Q-value）关键。

3.1 定量过滤(Quantification filtering)

可选“Group Q-value”（推荐默认）、“Min Q-value”、“Max Q-value”或“ChannelQ”。

“Group Q-value” 为跨通道综合评分；“Min Q-value” 至少一个通道需通过q < 0.01；“Max Q-value” 所有通道均需通过q < 0.01。

“Cross-run normalization” 使用所有通道之和推荐开启以稳定通道间差异。

“Exclude All Multi-Channel Interferences” 必须开启，以排除干扰离子（如pSILAC中的b离子）。

“Minimum Log2 intensity” 推荐设定值为3，用于排除极低的定量值。

3.2 工作流定义(Workflow)

在“Workflow”设置中选择“From Library Settings”以自动继承前一步设定（例如“Labeled” workflow）。

可为数据后续分析定义条件（Conditions）和颜色（Colors），便于结果可视化与后续分析。此设置可在分析后阶段修改。

选择好所有参数后启动分析。

分析完成后，Spectronaut提供以下多通道数据质控的可视化功能：

Scoring Weight per Channel Plot

显示每个通道在不同样品和时间点上的得分权重。

位置：Post Analysis → Scoring Histograms。

H/L Ratios Boxplot

显示每个样品和时间点的H/L比值分布，快速质控整体标记效率。

位置：Post Analysis → SILAC H/L Ratios。

H/L Cross Run Ratios Plot

对单个蛋白质的轻重通道强度绘制线性拟合，斜率即代表蛋白H/L比值。可进行过滤或手动挑选前体进行定制化分析。

位置：Analysis标签，选具体蛋白，在Across Runs选项卡内选择H/L Cross Run Ratios Plot。

Spectronaut分析完成后提供以下主要输出供后续工具（如KdeggeR）使用：

导出用于KdeggeR的数据：

要包含前体唯一ID列（EG. PrecursorId）与PG唯一ID列（PG. ProteinGroups）；

要导出轻信号（EG. Channel1Quantity）与重信号（EG. Channel2Quantity）。

导出特定通道q-value以便自定义过滤：

EG.Qvalue（elution group整体的q值）；EG.Channel1Qvalue 和 EG.Channel2Qvalue（单独通道的q值）；EG.MinChannelQvalue 和 EG.MaxChannelQvalue（进一步通道过滤的q值）。

以上，我们梳理了Spectronaut在脉冲SILAC（pSILAC）数据分析每一步的具体操作逻辑。原文及其附件公开了详细的分析流程和软件参数设定，我们特此进行了中文整理与归纳，以方便国内研究人员更好地掌握和应用pSILAC技术。

如需了解更多细节或引用原始数据，请参考原始文献（见文末）。希望能够为大家解决pSILAC数据分析中的实际难题，更为各位的蛋白质组学研究增添新的助力与灵感。