项目文章 | 山东省科学院刘昌衡研究员海洋动物—刺参代谢组学研究新成果

2020年1月欧易/鹿明生物合作客户山东省科学院刘昌衡研究员在Food Chemistry期刊上发表题为“Hot water pretreatment-induced significant metabolite changes in the sea cucumber Apostichopus japonicus”的研究成果。本研究利用GC-MS代谢组学、LC-MS代谢组学平台及其它生理生化实验技术分析未经处理（UT-BW）和经过热水处理的刺参体壁（HW-BW）以及刺参的热水提取物（HW-E）（样本策略）。

结果显示矿物质，蛋白质，碳水化合物，皂苷和亚精胺等物质在热水处理后显示出重大损失。HW-BW与UT-BW和HW-BW与HW-E的多变量比较显示氨基酸和脂肪酸的增加，表明热水引起蛋白质、脂质或者其他成分的降解或转化。这些数据表明，需要新的加工技术来保持海参的全部营养价值。该研究结果将为海参行业开发新的且影响较小的加工策略以预防自溶同时保持营养价值提供参考。

海参是重要的水生物种，由于其营养和治疗的益处，海参已成为中国最受欢迎的保健食品之一。该动物的主要可食部分是海参体壁（一种胶原蛋白组织），已被用作血液生成的营养补充剂。物理参数的变化通常与海参的收获或栽培有关，并且会导致体壁几乎立即自溶，这导致收获后质量严重下降，从而造成严重的经济损失。因此，收获后立即用热水处理10-60分钟，使负责自溶的内源蛋白酶变性。这通常是加工海参的第一步。然而，热水预处理会导致某些营养素和生物活性成分的流失，从而降低饮食中加入海参的健康益处。尽管热水处理对饮食益处有潜在的负面影响，但迄今为止，对热水处理引起的代谢产物损失进行量化的研究很少见。

这项研究旨在全面表征热水处理引起的刺参代谢产物的损失，包括总蛋白质和碳水化合物，以及皂苷，矿物质，氨基和脂肪酸。因此，通过GC-MS代谢组学以及LC-MS代谢组学分析了热水处理过的体壁（HW-BW），热水处理的体壁提取物（HW-E）和未处理的体壁（UT-BW）。构建多变量统计模型以探讨不同组中代谢物谱的差异。该研究为热水预处理的后果以及对健康和营养价值的下游影响提供了新的见解。

1、未经处理和经热水处理的海参体壁和热水提取物中蛋白质，总碳水化合物，皂苷和矿物质的含量分析

海参中脂肪含量低，但蛋白质含量高，分别占不同物种干重的0.3％-10％和41 – 63％。HW-BW中蛋白质和钾的浓度显著高于未处理的对照，未观察到碳水化合物或所研究的其它矿物质有所增加（表1）。为了定量研究海参热水加工过程中的代谢物损失，将HW-BW和HW-E中存在的化合物浓度总和与未处理的对照进行了比较（表1）。蛋白质，碳水化合物，皂苷和矿物质如表1所示。HW-BW + HW-E的质量平衡与UTBW并无显着差异，除了铁和钾，铁的含量略显重要（102.14％），而钾的含量高估了192％ （表1）。热水预处理导致海参体壁中总蛋白质（约11.5％），碳水化合物（约33％）和皂苷（约41％）的大量损失，矿物质损失记录了相似的百分比范围，其中Na（ 约69％），其次是Mg（约59％），P（约49％），Ca（约32.5％），Zn（约26％）和Fe（约12％）（表1）。与通常报道的海参体壁蛋白质含量相比，本研究获得的刺参样品降低了2-3倍。海参的营养价值可能取决于物种，并且受海参饮食和环境的影响，因此难以在不同物种间进行定量比较。

皂苷是日常饮食的组成部分，但饮食中皂苷的主要摄入量是豆类，例如鹰嘴豆和小扁豆，根据季节，品种，环境条件和土壤特性，鹰嘴豆中的浓度范围从0.75-5.6 mg / g不等。对日本刺参样品测定的皂苷含量约鹰嘴豆中最高值的50％，但通过热水预处理提取的皂苷含量约41％（表1）。海参的皂苷是三萜糖苷，通常由三萜和碳水化合物组成，是海参最重要的生物活性成分。动物模型和一些临床试验表明，饮食中的皂苷可以带来健康益处。皂苷谱可能是生物活性的决定性因素，因为从海参中纯化的皂苷的肠道吸收研究表明，皂苷A的吸收较高，而全毒素A1的吸收较低。已发表的研究指出了不同来源的皂苷生物活性的差异。在本研究中，热水预处理的海参中皂苷的大量损失表明，需要开发替代加工技术以最大程度地减少损失。

尽管之前有研究人员对一种海参Stichopus japonicus的矿物含量进行过调查。但到目前为止所知，还没有对刺参的矿物质成分进行过定量研究。冻干材料与热水预处理后中的钙和镁含量相当，并且也鉴定出了低水平的铁，锌和磷，这与之前的研究结果一致。在两个属中，钠的浓度也相似。相反，未经处理的刺参的钠钾比例仅为11.3，仍高于控制高血压的推荐比例1.4。除此之外，热水预处理导致日本刺参的矿物质流失达到25％至> 50％，考虑到矿物质营养在健康和疾病中起着重要作用，这项研究表明应该研究其他影响较小的加工技术。

表1 | 刺参UT-BW，HW-BW和HW-E中的总蛋白质，碳水化合物，皂素和矿物质含量

2、热水预处理对海参体壁代谢物谱的影响

为了研究热水预处理对海参代谢产物谱的影响，运用GC-MS代谢组学和LC-MS代谢组学平台对UT-BW，HW-BW和HW-E组进行代谢物检测，并对所获数据进行PCA和OPLS-DA分析。数据表明，UT-BW，HW-BW和HW-E组内差异聚集良好，组间分离明显，表明这些组中的代谢物差异显著，热水处理导致了刺参体壁代谢物图谱的改变。

在UT-BW，HW-BW和HWE中运用GC-MS平台鉴定到了212、273和249种代谢物，运用LC-MS平台鉴定到了2276、2373和2543种代谢物。

GC-MS代谢组学平台在UT-BW和HW-BW比较组中共鉴定出279种代谢物，其中有206种代谢物（73.8％）两者共有，26.2％非共有（表2）。对于HW-BW和HW-E，通过GC-MS平台共鉴定出291种代谢物，其中有231种代谢物（79.4%）共有，20.6％非共有。

通过LC-MS代谢组学在UT-BW和HW-BW比较组中共鉴定出2494种代谢物，其中有2155种代谢物（86.4％）两者共有，13.6％非共有。同样，通过LC-MS平台在HW-BW和HW-E中鉴定出的2608种代谢产物中，有2308种共有(88.5％)， 11.5％非共有。

为了辨别HW-BW＆HW-E中的代谢物是否与UT-BW中的代谢物相同，比较了UT-BW和HW-BW＆HW-E中的代谢物谱。在UT-BW和HW-BW＆HW-E中共鉴定出292种不同的代谢产物，其中211种共有，81种非共有。LC-MS在UT-BW和HW-BW＆HW-E中鉴定出2647个代谢物，其中2237个相同。这些结果表明，热水预处理引起刺参代谢物谱的显著改变。

表2 | 不同比较组差异代谢物统计分析

3. 未经处理和热水处理的海参体壁代谢物谱的比较

在HW-BW与UT-BW比较组中，通过GC-MS代谢组学平台鉴定出25种差异表达的代谢物（VIP＞1，P＜0.05），包括氨基酸及其衍生物（11），脂肪酸（5），核酸及其衍生物（4），维生素（1），有机酸（1）和其他（3）（表3）。这表明热水预处理导致蛋白质降解，但保留了大多数所得氨基酸，或者从HW-BW提取更容易，更完全。

同样，热水预处理中的游离脂肪酸浓度也以亚麻酸>亚油酸>花生四烯酸>油酸>硬脂酸的降序增加（表3）。对于琥珀酸和α-生育酚也观察到相同的情况。相反，尿嘧啶和5,6-二氢尿嘧啶的比例表明，热水预处理导致海参体壁RNA丢失，而肌苷却被溶解并保留下来。后者可能会增加海参饮食对健康的潜在益处。

在HW-BW中检测到大量的角鲨烯，这可能表明海参固醇/皂苷的降解，可能会降低海参固醇的神经保护作用。此外，观察到褪黑素和肌醇的净损失（表3），这进一步表明，热水预处理海参可能导致海参的潜在健康益处降低。据报道，褪黑激素在许多生理过程中起着至关重要的作用，例如昼夜节律的调节，体重指数维持繁殖，免疫反应，神经和心脏保护以及抗肿瘤；补充肌醇的饮食具有抗氧化，降血脂，抗癌和抗糖尿病作用。

表3 | HW-BW和UT-BW之间的差异代谢物分析（GC-MS）

根据LC-MS代谢组学数据的代谢物差异表达分析（表4），热水预处理导致甘油磷脂（66），甘油脂（11），脂肪酸（棕榈酸，DHA，EPA），一种鞘脂L -肉碱和硫酸软骨素，这是GC-MS尚未鉴定出的其他代谢物变化。特别地，必需的长链多不饱和脂肪酸，甘油磷脂和包含它们的甘油脂的损失是可能是热水预处理后刺参营养损失的重要原因。

表4 | HW-BW和UT-BW之间的差异代谢物分析（LC-MS）

4. 热水处理的海参体壁和热水提取物中代谢物谱的比较

GC-MS代谢组学对HW-E的分析表明了脂肪酸，维生素和大多数核酸的净损失小于<1％，除了RNA的损失（如5,6-二氢尿嘧啶的损失，而非尿嘧啶的损失），在HW-E中检测到5,6-二氢尿嘧啶可得出以下结论：热水预处理会导致海参体壁中RNA丢失。

相反，有机酸的净损失通常较大，约10％（表5），这可能反映出这些化合物在水中的溶解度更高。在HW-E中鉴定出少量角鲨烯（表5），证实了基于HW-BW / UT-BW比率的结论，即在热水预处理的海参体壁中保留了甾醇/皂甙衍生的角鲨烯。类似地，还确认了肌醇的10％的轻微净损失。此外，海参体壁的热水预处理导致所检测到的亚精胺100％丢失。亚精胺已被确定为无脊椎动物的重要组成部分，包括海参，已显示具有开发抗精神病药物的潜力。因此，海参体壁中亚精胺的完全丧失可能会降低海参饮食对精神健康的潜在益处。

表5 | 热水诱导的代谢物损失，基于GC-MS分析HW-E

LC-MS代谢组学对HW-E的分析确定了77个甘油磷脂，7个甘油脂，1个鞘脂，2个脂肪酸和1个氨基酸（氨基己酸），1个核酸衍生物（尿苷）和1个维生素（泛酸）（表6）。热水预处理导致33种甘油磷脂的净损失大于10％。值得关注的是，在33种磷酸甘油脂中，有8种含有高水平的DHA，而在磷酸甘油脂中未检测到EPA，但定量为游离脂肪酸，净损失大于10％。HW-BW与HW-E的比较表明，由于热水预处理，海参体壁上的鞘脂（cer（d18：0/18：0））的净损失约6.5％。GC-MS未检测到EPA和棕榈酸（净损失8.8和3.9％，表6），也未检测到维生素泛酸（净损失约12％，表6）或核酸衍生物尿苷（净损失小于1％，表6）。

因此，为了获得预处理引起的养分流失的完整概况，需要使用两种分析技术（GC-MS和LC-MS）。同样值得注意的是，DHA，泛酸，鞘脂（cer（d18：0/18：0））和饮食中的尿苷水平都被认为在维持大脑健康和神经保护中起着至关重要的作用。例如，泛酸对于CoA的产生以及脂肪酸和羧酸的代谢至关重要，神经酰胺是鞘磷脂的分解产物，是重要的脂质信使并参与细胞凋亡。同样，尿嘧啶（UMP，似乎对突触形成很重要），在本研究中被怀疑代表mRNA的水解产物。

尽管从百分比净损失的角度来看，某些化合物的损失并不过分，但获得的数据清楚地表明，对海参体壁进行热水预处理会导致有益营养素的损失和水溶性较低化合物的保留。

实际上，保留的水解产物可以改善消化吸收并带来更大的营养益处。为了充分了解海参热水预处理的营养结果，后续研究应旨在量化这些生物活性化合物和水解产物的含量，因为对健康的益处与不利影响在很大程度上取决于含量。

表6 | 热水诱导的代谢物损失，基于LC-MS分析HW-E

必须在收获后立即通过热水预处理使其变性，因此这是几乎所有海参加工技术中的常用步骤。本研究确定了热水预处理对海参体壁代谢物谱的显著影响，并且在热水提取物中观察到净损失。热水预处理导致蛋白质，总糖，皂苷和无机元素的损失，从而导致海参体壁代谢物发生变化。多变量分析表明，UT-BW，HW-BW和HW-E中的代谢物明显不同。根据在HW-BW和HW-E中通过GC-MS代谢组学和LC-MS代谢组学鉴定出的相同代谢物，得出的结论是一定程度上提取了80％和88.5％的代谢物。甘油磷脂，氨基酸及其衍生物，甘油脂和脂肪酸是各组之间的主要差异代谢物。

热水预处理后，大多数氨基酸和脂肪酸的浓度增加，这可能是由于蛋白质，脂质或其他成分的降解或转化所致。相比之下，与UT-BW中的水平相比，HW-BW中的DHA，EPA和大多数甘油磷脂减少了。这项研究表明，热水预处理可引起许多代谢物的显著变化和损失，并可能对营养健康产生影响，其中包括100％的亚精胺（一种潜在的抗精神病药物）净损失。未来的研究需要集中在量化这些变化上，因为有益或不利的健康影响高度依赖浓度。

本研究利用GC-MS代谢组学、LC-MS代谢组学平台及其它生理生化实验技术分析未经处理（UT-BW）和经过热水处理的刺参体壁（HW-BW）以及刺参的热水提取物（HW-E），结果显示矿物质，蛋白质，碳水化合物，皂苷和亚精胺等物质在热水处理后显示出重大损失。

这项研究表明，热水预处理可引起许多代谢物的显著变化和损失，并可能对营养健康产生影响。该研究数据表明，需要新的加工技术来保持海参的全部营养价值。该研究结果将为海参行业开发新的且影响较小的加工策略以预防自溶同时保持营养价值提供参考。

参考文献：

Florian Meier et al. diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods. 2020 Dec;17(12):1229-1236.

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Kushi Jean  撰文

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