TPP与LiP-MS筛选出的药物靶点如何验证？一文在手，验证不愁——PART 1: 功能篇

2024-11-14 15:39:57 北京青莲百奥生物科技有限公司

药物靶点在医药研发中至关重要，它们是药物作用的生物分子，涵盖蛋白质、酶、受体等，对调节生物体的生理和病理过程起着决定性作用。药物靶点的发现和验证是新药研发的首要步骤，直接关系到研发的成败。

青莲百奥药物靶点发现解决方案

此前，青莲百奥率先提出药物靶点发现解决方案--通过热蛋白质组学（TPP）/限制性酶解-质谱分析（LiP-MS）加速小分子药物靶点发现，但当我们从几十到几百个特异性蛋白中生信筛选出候选靶蛋白后，如何来验证蛋白与小分子的相互作用呢？分析互作的方法有哪些？该如何选择呢？小编从文章中总结了相关内容，请您接着往下看~

药物靶点验证方法

小编阅读了大量的高分期刊文章，归纳出药物靶点验证的两大主要策略：功能验证和结构验证。功能验证包括细胞热位移实验（CETSA）、基因敲低技术和动物实验，这些方法随着研究的深入逐步应用，主要关注分子层面和动物模型的实验；结构验证包括分子对接、表面等离子体共振（SPR）、微量热涌动（MST）和等温滴定量热法（ITC），从亲和力、结合常数Ka和解离常数Kd维度验证药物与靶点是否有相互作用。

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本期让我们具体看一下

文章中功能验证是怎么做的吧~

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CETSA--必做

细胞热转移实验 (cellular thermal shift assay，CETSA)常用于评估细胞和组织内药物与靶蛋白结合效率的实验，直接监测完整细胞和组织样品中蛋白质相互作用状态的功能调节，也可用于验证某一药物与靶蛋白的结合关系。发现潜在药物靶点后，CETSA技术能立即用于初步验证，为您的药物研究迈出关键的第一步！

技术原理

靶蛋白与药物分子结合时通常会变得稳定。随着温度的升高，蛋白会发生降解；当蛋白结合药物后，相同温度下，未降解蛋白的量会提高，该复合蛋白的热熔曲线会右移。其样品来源可以是细胞，也可以是组织，检测方法主要有免疫印迹（Western blotting）和蛋白质谱（MS）。

CETSA基本原理图^[1]

文章应用

2024年4月，中山大学附属第一医院周怡团队在期刊Adv Sci (Weinh)（IF=14.3）上发表了题为“A Natural Small Molecule Mitigates Kidney Fibrosis by Targeting Cdc42-mediated GSK-3β/β-catenin Signaling”的研究论文，该研究对大鼠正常肾成纤维细胞（NRK-49F细胞）进行二萜类化合物--daphnepedunin A（DA）处理，首先利用TPP技术筛选到了药物靶点Cdc42，后续进行了CETSA实验，该实验表明DA处理后，Cdc42的热稳定性变差，提前降解，验证了此蛋白是RA的靶点。

CETSA表明Cdc42是RA的靶点^[2]

敲低实验--常规必做

敲低实验是进行机制研究的重要工具，通过观察基因沉默后细胞或生物体的表型变化，以推断基因功能和药物作用机制。

技术原理

在细胞或生物体中通过RNA干扰（RNAi）等方法降低目标基因表达水平，使其功能受到抑制。RNAi通常通过合成人工转录后小干扰RNA（siRNA）或利用稳定的反义RNA（shRNA）介导靶向降解mRNA来实现。由于RNAi的效果通常是部分抑制目标基因的表达，因此被称为基因敲低。

文章应用

2024年8月，海军医科大学胡良皞团队在期刊J Gastroenterol（IF=6.9）上发表了题为“Corynoline protects chronic pancreatitis via binding to PSMA2 and alleviating pancreatic fibrosis”的研究论文，该研究对人多能干细胞（HPSC细胞）进行紫堇灵（中药单体）孵育处理，首先利用LiP-MS技术筛选到了药物靶点PSMA2，后续进行了敲低实验，实验结果表明PSMA2介导紫堇灵的抗纤维化作用，PSMA2是紫堇灵的药物靶点。

敲低实验表明PSMA2介导紫堇灵的抗纤维化作用^[3]

动物实验--高分必争

动物实验是用明确遗传背景、受控微生物的动物进行的科研活动。靶点验证进行到这一环节基本是接近尾声了，此前两个方法进行实验大多是从细胞的维度进行，动物实验则探究基因或蛋白在体内作用及分子机制，对于验证药物靶点的有效性和安全性至关重要，同时也能增强科研成果的说服力。

技术原理

药物靶点进行动物实验，一般是是进行敲除/敲低小鼠来对探究基因或蛋白在体内作用及分子机制有着重要意义。

文章应用

2022年12月，广州医科大学第一附属医院李斌团队在期刊Adv Sci (Weinh)（IF=14.3）上发表了题为“Blockade of Nuclear β-Catenin Signaling via Direct Targeting of RanBP3 with NU2058 Induces Cell Senescence to Suppress Colorectal Tumorigenesis”的研究论文，该研究对结直肠癌细胞（CRC细胞）进行NU2058（小分子药物）孵育处理，首先利用LiP-MS技术筛选到了药物靶点RanBP3，经过细胞层面的靶点验证后，继续利用RanBP3敲低的BALB/c-nu无胸腺裸鼠进行肿瘤异植模型研究，通过检测肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤生长指数等后，实验结果表明RanBP3缺失后，促进肿瘤生长，RanBP3是NU2058的关键靶点。

动物实验表明RanBP3是NU2058的关键靶点[4]

总结

药靶靶点验证是医药研发的重要一环，本期介绍了CETSA技术通过监测蛋白质热稳定性的变化，为药物与靶点的初步结合提供了直接证据。基因敲低技术则通过降低特定基因的表达，揭示了基因沉默后细胞功能的显著变化，进一步验证了靶点的作用。动物实验则在整体层面上模拟了药物的作用效果，为药物的体内活性和安全性提供了关键数据。这些实验结果相互印证，共同揭示了药物靶点的生物学功能和药物的潜在疗效，为药物开发和疾病治疗提供了坚实的科学基础。未来研究可进一步探索这些技术的优化和组合应用，以提高药物靶点验证的准确性和效率。

【参考文献】

[1] Tu Y, Tan L, Tao H, et al. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products [J]. Phytomedicine, 2023, 116.

[2] Hu X, Gan L, Tang Z, et al. A Natural Small Molecule Mitigates Kidney Fibrosis by Targeting Cdc42‐mediated GSK‐3β/β‐catenin Signaling [J]. Advanced Science, 2024, 11(13).

[3] Wang P, Huang B, Liu Y, et al. Corynoline protects chronic pancreatitis via binding to PSMA2 and alleviating pancreatic fibrosis [J]. Journal of Gastroenterology, 2024, 59(11): 1037-1051.

[4] Zheng C C, Liao L, Liu Y P, et al. Blockade of Nuclear β‐Catenin Signaling via Direct Targeting of RanBP3 with NU2058 Induces Cell Senescence to Suppress Colorectal Tumorigenesis [J]. Advanced Science, 2022, 9(34)