方案推荐|奥谱天成ATR8800冬季高发呼吸道疾病的快速检验

冬季是呼吸道感染疾病的高发期，目前我国流行的呼吸道疾病由多种病原体引起，包括细菌、支原体、流感病毒以及引发全球大流行的新型冠状病毒等。鉴于呼吸道疾病具有传染性高、传播速度快的特点，且不同病原体引发的呼吸道感染在症状和治疗方面存在显著的差异，因此及早进行检测和确诊是有效遏制呼吸道疾病扩散的重要手段。尽管传统的分离培养方法在准确性和权威性方面具备显著优势，但由于其操作繁琐、耗时较长，以及涉及生物安全风险等缺点，已经无法满足当前临床检测的实际需求。目前主要采用的检测方法包括核酸检测和免疫学检测，然而这些方法都要求配备专业实验室设备，操作人员需要接受专业培训，成本相对较高，同时检测周期也较为冗长，无法满足迅速增加的呼吸道疾病样本大规模现场检测的迫切需求，因此迫切需要开发新型的呼吸道病毒检测技术。

当光照射到物质上发生散射时，波长发生变化的散射光被称为拉曼散射。波长发生改变的原因是光子与被照射物质分子间发生能量转移后，分子振动能级发生了改变，而光子在不同物质上发生拉曼散射时转移的能量不同，就可特异性识别被照射物质种类。而表面增强拉曼光谱(SERS)技术则是在普通拉曼散射的基础上将被照射物质吸附或连接于粗糙贵金属表面，使拉曼信号强度获得极大提升。在普通拉曼散射固有的无损分析、不受水成分影响、样品不需要复杂处理、检测速度快、使用便携式仪器可进行现场分析等优势基础上，SERS技术具有更高的灵敏度，在某些条件下可以达到单分子检测水平。通过分析患者的生物样本，这项技术可以迅速检测特定的分子标志物，从而确定引发呼吸道疾病的特异致病原。有助于医疗专业人员更早地作出确切的诊断，为患者提供更及时、个体化的治疗方案。通过缩短诊断时间和减少传统检查的繁琐过程，快速检验方法有望在防控传染病、提高医疗效率和减轻医疗负担等方面发挥关键作用，为呼吸道疾病的治疗提供更为有效的支持。

SERS技术在新冠病毒(COVID-19)检测方面的应用

新型冠状病毒是第7种能感染人类的冠状病毒且具有极高的传染性，因此开发一种超快速、高灵敏的新型检测方法显得尤为紧迫。LEONG等人设计了一款基于SERS技术的手持式新型冠状病毒检测仪。该仪器内部集成了三种芯片，分别搭载了2-巯基苯甲酸、4-巯基吡啶和三磷酸腺苷3组SERS探针分子。这些SERS探针分子被固定在银纳米颗粒表面上。在检测过程中，被检者向设备呼气约10秒，由于呼气中的新型冠状病毒生物标志物与传感器发生化学反应，因此可以通过SERS信号的变化对反应后的化合物进行表征。对于在医院和机场对501人进行的新型冠状病毒现场检测，LEONG等人的研究结果显示，该检测方法的假阴性率为3.8%，假阳性率为0.1%。这与聚合酶链反应检测相比具有相当的准确性，而且成本更低，检测时间仅需5分钟。值得注意的是，该仪器不仅能够检测生物源挥发性有机物的种类变化，还可用于筛查其他类型的呼吸道病毒感染。

图1 基于呼吸挥发性有机化合物识别新冠病毒阳性个体的方案设计

流感病毒具有较高的传染性和变异率，可能引发季节性流行，甚至导致全球性大流行，对公共卫生造成严重负担。因此，迫切需要研究一种准确和迅速的流感病毒检测方法，以在流感爆发前通过及时、精确的检测来遏制其传播。Chen等研发了一种基于双模式表面增强拉曼散射(SERS)的适体传感器，可同时准确诊断和区分新冠病毒和甲型H1N1流感。在这一技术中，具有选择性结合SARS-CoV-2和甲型H1N1流感的DNA适体被共同固定在爆米花状的金纳米基底上。拉曼报告基因(Cy3和RRX)，连接到DNA适体末端，可在金纳米基底的纳米间隙中产生强烈的SERS信号。同时，内标拉曼报告基因(4-MBA)与适体DNA一同固定在金纳米基底上，以减小测量环境变化引起的误差。当SARS-CoV-2或甲型流感病毒接近金纳米基底时，由于相应的DNA适体与病毒之间存在显着的结合亲和力，相关的DNA适体会选择性地从基底上分离。因此，随着目标病毒浓度的增加，相应的SERS强度逐渐降低。这种基于SERS的DNA适体传感器可迅速确定疑似患者是否感染了SARS-CoV-2或甲型流感，同时以高灵敏度定量评估目标病毒浓度，不受交叉反应的影响。

图2 (a) 感染SARS-CoV-2或甲型流感时出现的症状，以及用于诊断的RT-PCR和快速抗原试剂盒;(b)爆米花状金纳米基底的照片和SEM图像;(c)用于病毒检测的双适体固定爆米花状金纳米基底的工作原理

细菌感染是致死的主要原因，在发达国家和发展中国家每年夺去670万人的生命。这些感染的治疗费用也很高，仅在美国就占年度医疗支出的8.7%，即330亿美元。目前的诊断方法需要进行样本培养来检测和识别细菌及其抗生素敏感性，这是一个缓慢的过程，即使在最先进的实验室中也可能需要数天的时间。通常在等待培养结果时会开出广谱抗生素，根据疾病控制和预防中心的数据，超过30%的患者接受了不必要的治疗。因此需要快速、无培养诊断细菌感染的新方法，以便能够更早地开出针对性抗生素并帮助减轻抗菌素耐药性。拉曼光谱有潜力识别细菌的种类和抗生素耐药性，当与共焦光谱结合时，可以机械能单个细菌细胞的分析。不同的细菌表型具有独特的分子组成，导致其相应的拉曼光谱存在细微的差异。然而，由于拉曼散射效率较低(~10⁻⁸散射概率)，这些细微的光谱差异很容易被背景噪声掩盖。因此，需要高信噪比才能达到高识别精度，通常需要很长的测量时间，而这阻碍了高通量单细胞技术的发展。此外，大量临床相关物种、菌株和抗生素耐药性模式需要全面的数据集，而这些数据集在专注于区分物种分离株或抗生素敏感性的研究中并未收集到。Ho等人通过SERS技术结合卷积神经网络训练应对了这一挑战，通过分离、经验治疗和抗生素耐药性对细菌SERS光谱进行分类。

图3 卷积神经网络用于从SERS光谱中识别细菌

随着SERS技术的进步，目前在检测领域主要有三种应用思路：(1) 将特异性核酸序列和抗体附着在纳米颗粒表面，构建SERS标签，从而在复杂体液中实现对呼吸道病毒的准确检测;(2) 利用新型增强基底制备技术，使纳米颗粒之间的“热点”尺寸更适合病毒颗粒，提高检测效率、降低成本，同时有效避免了唾液、血液等生物背景对检测结果的干扰;(3) 与其他检测技术联合应用，如SERS-色谱联合技术，将SERS增强基底组装到光纤上作为高灵敏的检测传感器。此外，结合SERS和等离子体传感可用于生物分子相互作用的高灵敏度定量检测。SERS技术克服了普通拉曼光谱信号较弱的缺点，提供了难以获得的结构信息。

SERS技术在呼吸道疾病病原检测中取得显著进展，然而，为了更全面、深入地研究和诊断呼吸道病毒，研究者通常会选择使用共聚焦显微拉曼光谱仪。这种仪器结合了激光共聚焦显微镜和拉曼光谱仪的特点，为呼吸道疾病病原的SERS检测提供了独特的优势：

高空间分辨率：共聚焦显微拉曼光谱仪具有高分辨率的成像能力，能够在微观尺度上观察样品的结构和组织。在呼吸道疾病病原检测中，这种高空间分辨率能够帮助研究者准确定位和观察微小的病毒颗粒或细胞结构。

深度信息获取：共聚焦显微拉曼光谱仪可以实现三维成像，为研究者提供样品内部的深度信息。这对于理解病原体在不同细胞层次上的分布和相互作用至关重要，有助于更全面地了解呼吸道疾病的发展过程。

实时监测：共聚焦显微拉曼光谱仪具备实时监测功能，可以追踪样品中病原体的动态变化。在呼吸道疾病的研究中，实时监测有助于研究者了解病毒的生命周期、感染过程以及治疗干预的效果。

减少背景干扰：共聚焦显微拉曼光谱仪通过对焦点进行精确控制，能够减少背景信号的干扰。这对于在复杂的生物样本中进行高灵敏度的SERS检测尤为重要，以确保检测结果的准确性和可靠性。

奥谱天成ATR8800系列显微拉曼光谱仪，集成了最多达4个激光器，并结合了显微镜及拉曼光谱仪两者的优点，显微拉曼检测平台使得“所见即所测”成为可能，可视化的精确定位拉曼检测平台，使得观测者可以检测样品上不同表面状态的拉曼信号，并可在计算机上同步显示所检测位置的微区形态，极大便利了拉曼微区检测。

ATR8800全系列可以进行全自动对焦、全自动扫描，一键操作，可以进行批量实验、均匀性扫描等，无需等待，且可以获得高可靠性的扫描成像拉曼数据;

ATR8800配备不同焦距的光谱仪，以达到不同分辨率的要求，ATR8800还配备专门为拉曼系统设计的物镜，使得激光光斑接近衍射极限，再通过500万相机将焦点信息准确直观的显示在电脑上。克服了普通的拉曼系统中收集拉曼信号的焦面稍高于或稍低于实际最佳焦面的问题，从而提高拉曼光谱质量。

ATR8800完美地解决了相机成像时光路的损失，实现了相机成像与拉曼信号收集的分离，从而得到最佳的信号强度。同时，ATR8800使用专门为显微拉曼系统优化的高性能拉曼，无论是灵敏度，信噪比，稳定性等，都是行业领先水平，为拉曼研究提供了强有力的保障。

姜恒,张哲,江申综述,等.表面增强拉曼光谱在呼吸道病毒检测中的研究进展[J].检验医学与临床, 2023, 20(14):2096-2099.

Leong, Shi Xuan, et al. "Noninvasive and point-of-care surface-enhanced Raman scattering (SERS)-based breathalyzer for mass screening of coronavirus disease 2019 (COVID-19) under 5 min." ACS nano 16.2 (2022): 2629-2639.

Chen, Hao, et al. "SERS-based dual-mode DNA aptasensors for rapid classification of SARS-CoV-2 and influenza A/H1N1 infection." Sensors and Actuators B: Chemical 355 (2022): 131324.

Ho, Chi-Sing, et al. "Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning." Nature communications 10.1 (2019): 4927.

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