小分子化合物结构确认

1. 高分辨质谱（HRMS）/质谱（MS）

与常规质谱相比，高分辨质谱（HRMS）测得化合物的分子量可精确至小数点后第四位，常用于辅助确定化合物的分子质量和和分子式，前提是通过核磁共振波谱已初步确定化合物结构。某些情况下，质谱可以起到结构确证的关键作用。

笔者曾解析一新化合物，在初步推断得到平面结构后，发现分子量与推断的结构不一致。仔细观察质谱发现，在分子离子峰右侧还有一M+2的离子峰（丰度比约3:1），才恍然醒悟分子结构中含有氯原子，新化合物结构得以破解。

卤素常有同位素峰，分子结构中存在的氯（Cl）和溴（Br）较典型，当分子中含有1个氯或溴时，相对丰度比分别为3:1或1:1；含有多个氯或溴时，笔者一般是手动计算，或采用Chemdraw中的Analysis m/z值来判断。

质谱解析中还有一条大家都比较熟悉的“氮规则”：化合物分子不含氮或含偶数个氮原子时，其分子离子的质量是偶数；化合物分子含奇数个氮原子时，其分子离子的质量是奇数。

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2. 元素分析

元素分析对化合物中的各元素进行含量测定，确定各元素的百分含量。

针对各元素的特点，元素分析可选择的方法较为多样。碳、氢、氮元素检测通常采用燃烧分解法；含卤素或硫的化合物，采用氧瓶燃烧-滴定法（中国药典2020年版四部通则0703）；金属元素可采用电感耦合等离子发射光谱法（ICP-OES）；磷元素可采用酸分解-比色法等。

测定完毕，比较测试结果与理论结果差值的大小，指导原则[1]规定“一般要求误差不超过0.3％”，在实际遇到的一些案例中，会存在样品容易吸潮或化合物含较多游离水，导致测试结果与理论结果误差超过0.3%。在元素分析解析时，建议元素百分含量测定值扣除化合物的水分测定结果后，再与理论值比较误差。

3. 一维核磁共振波谱

取化合物2mg~10mg装入核磁管，用合适的氘代试剂进行溶解，用核磁共振波谱仪（频率通常400M~800M）进行检测，内标物为四甲基硅烷（TMS）。

1H的天然丰度较13C高很多，核磁测试时，两者频率通常是4倍关系，如氢谱（1H NMR）600M频率对应碳谱（13C NMR）150M频率；碳谱的响应较氢谱低，如果化合物量较少，在测试碳谱时，可通过积累扫描时长增加碳谱的响应；分子量大的化合物较分子量小的化合物检测用量要多。

氘代试剂的选择也非常关键，比较常见的氘代试剂有DMSO-d6，CDCl3，D2O，Methanol-d4，(CD3)2CO等。某些情况下，化合物的化学位移可能与氘代试剂（或氘代试剂中存在的水）在氢谱或碳谱中的化学位移重叠，影响结构确证，就需要更换氘代试剂进行测定。

指导原则[1]规定“对含有活泼氢的药物必需进行氘代实验，以提供活泼氢的存在以及位置的信息。”，选择氘代试剂时，可采用重水交换来确认活泼氢的存在。同时，可结合二维1H-1H COSY谱进行确认。

核磁出图后，研发人员常用MestRenova软件对图谱进行化学位移和积分处理，采用Chemdraw软件预测化合物的氢谱和碳谱数据，辅助判断平面结构。

如果化合物为已知化合物，通过与文献报道的氢谱（1H NMR）或碳谱（13C NMR）数据进行比对，则较易解析。

微谱数据库可进行检索查新，目前数据库中已收载137万多种化合物的碳谱数据，为植物化学或天然产物研发工作者提供了较大的便利。只需在微谱数据库中录入已获得的碳谱数据，则能很快获得文献已发表化合物和待解析化合物的相似度。该数据库需要收费[4]。

除了氢谱（1H NMR）和碳谱（13C NMR），DEPT（无畸变极化转移增强技术）和APT（碳连氢谱）也是一维核磁波谱。DEPT和APT谱用得较少，它们的作用是判断碳的类型。普通13C-NMR出的化学位移棒均是“朝上（正）”，DEPT和APT谱出的化学位移棒“有上（正）有下（负）”，常用135°DEPT。在135°DEPT实验中所有的季碳都不出峰，伯、叔碳为正（棒朝上），仲碳为负（棒朝下）。APT谱中季碳可以出峰，信号强度较DEPT谱增加。

4. 二维核磁共振波谱

二维核磁共振波谱是对平面结构进行确证的关键。常用的为：HMBC（检出1H异核多键相干技术）、HSQC（检出1H异核单量子相干技术）、COSY（同核位移相关谱）、NOESY（核极化效应相关谱）。

HMBC对推断结构最为高效，它是看相隔2个或3个键氢原子与碳原子的远程相关性；COSY（通常是1H-1HCOSY）看相邻碳相连氢原子的相关性；HSQC看直接相连的碳氢相关性。通常通过这三种技术，即可初步确认化合物的平面结构。

JNP（Journalof Natural Products）杂志近期发表的某新的萜类化合物1的平面结构推断见图1，红色箭头表示的是根据HMBC谱推断的碳氢相关性，蓝色粗线表示的是1H-1H COSY谱推断的氢氢相关性。该化合物平面结构确证后，其相对构型通过NOESY谱进行确定，NOESY谱上可反映空间上的氢氢相关性，见图2，黑色箭头标出了空间氢原子相关。详细的解析过程和核磁共振图谱数据可查询参考文献[5]。

5. 圆二色谱（CD）

圆二色谱（CD）是用于推断非对称分子的构型和构象的一种旋光光谱，可用于确证化合物的绝对构型。

上述新化合物1在通过二维核磁波谱确定了平面结构和相对构型后，通过圆二色谱计算结果与实验结果的拟合（见图3），最终确定了其绝对构型。

6. 单晶X-射线衍射（XRSD）

单晶X-射线衍射（XRSD）也是确定绝对构型的常用方法，可测定晶态分子的晶胞参数、晶系、空间群，可提供一个化合物在晶态中所具有原子的精确空间位置。该技术主要涉及单晶培养和检测。晶体培养难度较大，需不断尝试且有足够耐心。