文献精读 | metaFISH：结合MALDI质谱成像和原位荧光标记成像以高空间分辨率可视化代谢物和微生物

基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）是一种无标记分子成像技术，可以直接同步绘制生物组织切片中数百种不同代谢物的二维离子密度图。然而，在宿主-微生物相互作用中，定位微生物并将代谢物分配给宿主与微生物仍然具有挑战性。因此，研究人员开发了在同一切片上将 MALDI-MSI 与荧光原位杂交 (FISH：Fuorescence In Situ Hybridization) 相结合，以识别和定位微生物细胞的一种成像方法。

在宿主-微生物界面精确定位单个代谢物是解决微生物互利共生和发病机制中代谢相互作用的关键挑战。结合代谢物的空间分布和组织内宿主、微生物的单个细胞类型，可以进一步理解宿主-微生物相互作用中的通信、防御和营养交换情况。虽然，空间蛋白质组学和转录组学使得在真核宿主中定位蛋白质和基因变得更容易，但一直缺乏研究复杂组织中微生物的代谢及位点特异性表型的可靠方法。因此，需要一种准确连接代谢物与其产生细胞的方法来揭示复杂组织中代谢异质性的来源，从而表征其代谢表型。

一直以来，研究人员通常使用色谱方法，结合质谱（MS）或核磁共振波谱分析，通过非靶向代谢组学检测组织中代谢物。然而，在不使用显微切割技术的前提下，会导致组织、细胞相关空间位置信息及其原位特定代谢指纹信息的缺失。质谱成像（MSI）技术能够绘制单个组织切片中数百种不同代谢物的高分辨率空间分布图。MALDI-MSI 可以分析完整的生物分子，包括聚糖和多数代谢物（如糖、脂质等）。商业硬件可实现约 5µm 高空间分辨率（像素大小）（表1）检测，这使得 MALDI-MSI 能够成功区分单个真核细胞。

截止目前，德国吉森大学 Bernhard Spengler 教授团队研发的 AP-SMALDI 和 Spectroglyph LLC.公司的 t-MALDI-2 离子源均可实现＜5µm 分辨率的 MALDI-MSI 检测。通常 5–10µm 的分辨率足以区分定植和未定植的真核细胞，但无法单独分辨多数细菌细胞 (~1µm)。由于缺乏物种和菌株特异性的代谢物生物标志物，即使在最高的空间分辨率下， MALDI-MSI 检测也不足以可靠地将细胞的代谢指纹分配给相应的微生物类群。因此，了解待测细胞的分类特性，并在细胞分辨率尺度绘制出代谢物的空间位置至关重要。然而，单个细胞的鉴定工作可通过使用抗体标记、荧光蛋白标记和荧光原位杂交（FISH）等方法来实现。其中 FISH 能够通过使用特定的荧光探针标记任何选定的的 DNA 或 RNA 序列。

本文研究人员结合荧光显微镜的高分辨率、FISH 探针的特异性和高分辨率 MALDI-MSI 开发了 metaFISH 方法，将代谢指纹与微生物群落的单个细胞联系起来。文章详细介绍了 metaFISH 的工作流程，在单细胞尺度进行核酸探针成像并将代谢物的空间分布分配给微生物组，描述了组织制备、基质喷涂、MSI 数据采集，使用核酸探针的组织杂交、荧光显微图像采集、数据整合到相关图像数据集分析等步骤。MetaFISH 的工作流程适用于环境微生物学家及临床科学家等科研工作者，此流程需要约2个工作日。

表 1：metaFISH测试的高分辨率MSI设备示例及其相关参数

基于 MALDI-MSI 和 FISH 技术可视化微生物及其代谢物空间分布的整个工作流程共分为7步：

其中以下三点尤为关键：

1、高分辨质谱成像的样品前处理；

2、优化质谱成像参数（平衡信号强度与样本烧蚀情况）；

3、MSI检测后样本固定（便于后续FISH检测）。

另外，由于 MALDI 质谱成像分析会损坏样品表面，为避免同一切片上的荧光原位杂交信号强度受到一定程度的影响，也可选用连续（相邻）组织切片分别应用于 MSI 和 FISH 检测。

图1 使用 MALDI-MSI 和 FISH 以高空间分辨率可视化代谢物和微生物的工作流程(metaFISH)（MSI 数据来自AP-SMALDI-5 AF（TransMIT GmbH, Giessen, Germany））

在本方案中，研究人员重点关注不可培养的环境宿主-微生物系统的 MALDI-MSI 检测和荧光标记成像，这些系统与人体活检组织相媲美，在样本量、可追溯性和操作方面存在方法学上的挑战。

metaFISH 把 MALDI MSI 与 FISH 结合起来，能够将代谢物与基因的存在和表达联系起来。蚯蚓和深海贻贝体内均有共生细菌群落，且轮廓分明，metaFISH 已成功应用于二者的研究。同类成像方法也成功应用于宿主-微生物相互作用的天然产物研究，阐明了狼黄蜂茧表面的特定细菌细胞可产生抗菌化合物并共定位了海洋海绵中的生物活性化合物和细菌。该方法可同时检测寄主/致病菌和宿主的内源性代谢物、宿主的原位免疫反应代谢物、外源性药物等，未来可应用于更多领域，如环境和医学研究等。

metaFISH 实验设计的关键在于获取宿主体内细菌的位置和密度，明确其如何影响宿主的细胞代谢。通常在实验室模型中，感染部位和大致细菌数量是已知的，但对于病理样本和动物来源的样本，在进行 MetaFISH 分析之前，必须先对其进行表征。对于微生物群落组成未知的样品，建议选择合适且特异性强的 16S rRNA FISH 探针进行宏基因组测序。因此，建议保留部分样品分别用于不同的分析，如将一半组织/器官保存在合适的核酸保存固定液中用于宏基因组测序，另一半低温冷冻保存用于 MSI 和 FISH 检测。

metaFISH 可以在单个组织切片中同时绘制代谢物和细菌的空间分布。该方法获取的数据集包含数百个代谢物分布图像和荧光显微镜图像，能够呈现出组织、细菌及相关代谢物的分布，进一步获取代谢物分别与共生细菌、寄生细菌以及未定植宿主组织的共定位信息。如图2所示，该研究结合显微镜以不同空间分辨率呈现代谢物的 MSI 离子图。图2e所示为已发表的与 FISH 相关的 MALDI-MSI 数据，该数据由 AP-SMALDI（TransMIT GmbH, Giessen, Germany）采集，空间分辨率为3µm，可视化呈现了定植宿主和细菌细胞的空间分布，该数据集同时揭示了相似共生体定植细菌之间的代谢物差异。较大像素采集结果（10µm，图2c）显示特定局部代谢物的存在（如，未注释m/z 890.4951），该成分与贻贝鳃组织纤毛边缘寄生细菌的 FISH 信号相匹配。这种代谢物可能是细菌的产物，也可能表明贻贝宿主对感染的反应。

图2 metaFISH 分别以10µm 和3µm 空间分辨率揭示深海贻贝组织中与共生菌、寄生菌相关的代谢物分布

总之，本文介绍的 metaFISH 应用提供了在代谢物水平和高空间分辨率上对宿主-微生物相互作用的功能和化学生态学的深入了解。MALDI-MSI 技术的快速和持续发展使得微生物学家能够对微生物菌落、生物膜和单个真核细胞甚至细菌微菌落进行原位成像分析。如今，MALDI-MSI 成为研究单个细菌细胞代谢物的尖端技术，本文提出的 metaFISH 方案进一步为分析和理解这些微米级细菌代谢组提供了基础。

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