项目文章 | 热蛋白质组学分析发现多粘菌素B治疗细菌感染新靶点

2023年11月10日，深圳市人民医院黄维教授团队与青莲百奥合作在《Biomedicine & Pharmacotherapy 》( IF =7.5 )发表题为“The enhancement effect of small molecule Lyb24 reveals AzoR as a novel target of polymyxin B ”的研究成果。该研究通过化合物筛选发现小分子Lyb24增强和恢复了多粘菌素B（PB）对革兰氏阴性病原体的疗效，进一步利用热蛋白质组学（TPP）发现Lyb24的作用靶点AzoR，并对其作用机制进行更深入的研究。青莲百奥总经理李京丽、COO孙龙钦、CTO赵焱博士作为作者之一参与本研究，青莲百奥为本研究提供热蛋白质组学服务。

期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy

影响因子：7.5

发表时间：2023年11月10日

发表单位：深圳市人民医院

研究思路

研究结果

一、Lyb24增强了PB的活性

研究人员从肺炎克雷伯菌ATCC 13883中鉴定了15种单一浓度20 μg/ml（在0.25 μg/ml PB存在下>50%抑制）的活性化合物。其中，小分子Lyb1和PB联合使用表现出最强抑制效果，达到75.9%，Lyb1和PB之间的部分抑菌浓度指数FICI< 0.5（图1A-B）。由于 Lyb1是通过筛选具有随机结构的化合物而获得的，作者推测结构类似物可能是更有效的化合物。因此利用PubChem筛选了28个结构与Lyb1相似（相似度> 85%）的化合物。其中某些化合物在肺炎克雷伯菌ATCC 13883中最小抑菌浓度MIC值过高，即使在允许的最高浓度下也不能被抑制，无法计算FICI。最后选择小分子Lyb24进行深入研究，与PB联合使用时对肺炎克雷伯菌有效（FICI < 0.188）（图1C-D）。

Lyb24在鲍曼不动杆菌（FICI =0.375）、铜绿假单胞菌（FICI = 0.375）和大肠杆菌（FICI = 0.188）中也观察到了与PB的协同作用（图1E）。此外，对Lyb24和PB非肽的组合进行了测试，结果显示无协同效应，说明协同效应不是由于PB对膜的破坏从而使Lyb24达到其目标（图1F）。并进一步在mcr-1和mgrB缺失菌株证实了Lyb24在不同抗性机制上的增强PB活性（图1G）。

二、蛋白质组学揭示Lyb24增强机制

接下来研究人员采用蛋白质组分析来比较肺炎克雷伯菌（存在或不存在Lyb24、PB或Lyb24与PB结合）的蛋白表达。PB是一种阳离子抗菌肽（CAMP），其最初与脂多糖（LPS）的脂质A基于正负电荷的相互结合而发挥抗菌作用。因此对检测到的参与CAMP抗性的差异表达蛋白特别感兴趣（图2A），这些差异蛋白有助于将4-氨基-L-阿拉伯糖（L-Ara4N）添加到脂质A带负电荷的磷酸基团中，这是细菌对PB产生抗性的重要机制之一。进一步研究发现PB和Lyb24结合的L-Ara4N-脂质A偶联物降低，表明Lyb24抑制了脂质A修饰水平（图2B）。

此外，研究人员通过研究发现Lyb24影响细胞膜的通透性和完整性，将PB与Lyb24联合使用，可使细菌的膜电位去极化。透射电镜（TEM）图像显示细胞膜的破坏导致了细胞内容物的泄漏。

三、Lyb24蛋白相互作用谱分析

为了检测活细菌中Lyb24蛋白的相互作用，通过热蛋白质组学技术检测了整个蛋白质组中蛋白质热稳定性的变化。通过比较存在或不存在Lyb24培养的细菌在不同梯度温度处理下的细胞图谱，共鉴定出1098个蛋白，其中613个存在显著差异。随着化合物的加入，197个蛋白的热稳定性提高，其余416个蛋白的热稳定性降低（图3A）。其中热稳定性增强的蛋白质中AzoR与II型NADH-氧化还原酶（NDH-2）具有相同的NADH-氧化还原酶作用，而多粘菌素的另一种作用方式是抑制细菌内膜中重要的呼吸酶(NDH-2)。利用表面等离子共振（SPR）和差示扫描荧光法（DSF）实验进一步证实明Lyb24与AzoR相互作用并增强PB的抗菌活性（图3B-E）。

通过构建AzoR敲除菌株，发现AzoR敲除菌株中Lyb24对PB的协同效应减弱了，AzoR补体菌株恢复了对PB的敏感性和Lyb24的协同效应。这些结果表明，通过抑制AzoR的功能可以增强PB的抗菌活性。然而，过表达AzoR的菌株中Lyb24对PB的协同作用并没有改变（图3F-H）。

四、Lyb24和PB对AzoR活性的影响

对不同浓度的Lyb24或PB进行了动力学测量，研究其对AzoR的抑制作用。结果表明，Lyb24是奎诺二甲基丁酸酯的非竞争性抑制剂（图4A-F）。进一步验证了Lyb24和PB（亚致死浓度）对邻苯二酚等醌类药物的细菌生长的抑制作用，在没有外源物质的标准LB培养基中没有观察到(图4 G ) 。这些结果表明Lyb24和PB都能与AzoR结合并影响其功能，这可能是PB活性增强的一个原因。

研究人员通过结构分析表明，Lyb24通过pi-pi堆叠和AzoR的环η4与黄素单核苷酸（FMN）的异氧嘧啶环结合。并进一步利用小鼠肺炎模型证实了Lyb24增强了PB在体内的抗菌活性。

研究总结

本研究提供了一种潜在的治疗方案，通过联合Lyb24和PB治疗革兰氏阴性耐药的细菌感染。研究结果不仅解释了Lyb24的协同效应，并确证了AzoR作为PB新靶点从而扩展了对PB的作用机制的认识，并为PB佐剂的开发提供了新的候选机制。

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