空间蛋白质组揭示胶质母细胞瘤区域特征和药物敏感性差异

主成分分析(PCA)表明，样本聚类在很大程度上是由解剖小生境的蛋白质组学模式驱动的，而不是由患者之间的差异驱动的（图2a-c），分层聚类进一步支持了这一发现（图2d），突出了GBM中肿瘤内分子异质性。GSEA突出显示了一些在组织形态学小生境内的蛋白质水平上富集的途径（图2e）。肿瘤LE邻近正常神经组织与神经元系统的分子功能相关，而IT区域与神经元系统和干细胞相关通路相关。CT与分化和生长相关，PAN与应激、缺氧和免疫反应相关，MVP参与血管生成、免疫调节和对损伤的反应。这些结果表明GBM的蛋白质组可以被区域解构成特定于小生境的特征，这有助于降低复杂性，为不同区域表型提供更准细的生物学解释。

微解剖区域的蛋白质与Ivy GAP的转录谱最高相关性为0.4（图3a）。鉴定到总共1314个区域富集蛋白(图3b)，494个蛋白的mRNA前体也有一致的升高(图3c)。这些候选蛋白在特定GBM小生境中的RNA和蛋白质水平都相互升高，揭示了GBM分子异质性的重要非随机区域贡献。820个标记的仅在蛋白质水平上升高，而209个基因仅在RNA水平上升高，这些对比模式为理解通过转录后机制调节的通路特异性过程提供了重要途径。

使用免疫组化在独立患者样本验证代表性候选蛋白，确认A激酶锚定蛋白12（AKAP12）在PAN区域中富集（图3d–f）；免疫球蛋白CD276（B7-H3）在MVP区域富集（图3g–h）；CD276在脑实质内的非肿瘤血管中明显缺失，表明对GBM微环境免疫抑制性有潜在贡献（图3i）；验证了蛋白酪氨酸磷酸酶受体Z1（PTPRZ1）的存在，该候选物仅在IT区域有蛋白质水平的富集（图3j），在浸润细胞中表现出强烈的染色（图3k–l），并且研究表明该蛋白与肿瘤侵袭和侵袭性有关。

肿瘤组织区域（CT 和 PAN 样本）的分层聚类（图 4a）发现两个独立于样本区域注释的簇，也与肿瘤起源无关（图 4a）。对每个簇的功能特征分析揭示了簇1样本中显著富集的26个特征，包括GBM间充质、细胞迁移和KRAS靶点特征（图4b）。簇2具有11个不同的富集特征，包括GBM原神经、胚胎干细胞和MYC靶点特征。特征富集模式发现KRAS和MYC靶标特征之间存在负相关（图4c），尽管CT和PAN区域混合在一起，但这些解剖坐标在第三个缺氧分子标记轴上被相对分离（图4d）。基于IVY gap转录图谱验证了这种三轴分离（图4e），确认CT中高KRAS靶活性的样本与侵袭和上皮-间质转化过程相关，而富含MYC轴的样本与细胞周期进展相关。ROC分析发现蛋白质组学数据中MYC和KRAS基因集驱动的分组比Verhaak间充质和prooneural基因集产生更强大的样品分离（图4g）。GBM中的单细胞RNA谱分析表明功能性KRAS/MYC分化作为肿瘤内变异性的来源（图4h-j）。

该研究开发一种计算策略来推断CT小生境特异性特征，该策略用于组织学样本时，该特征产生与ssGSEA评分等效的结果，且不受到来自GBM样本中存在的其他生态位的干扰（图5a-b）。ssGSEA（图5c）在IVY Gap的RNA样本中观察到的KRAS靶点和MYC靶点之间的负相关性也通过TCGA-GBM（图5d）和CPTAC-GBM（图5e）研究的大量样本RNA数据中的CT特异性推断所证实。使用该推断模型表明，在CPTAC队列中，高水平的CT特异性KRAS靶信号与更具侵袭性的临床表型相关，总体生存期更短（图5f）。ssGSEA在TCGA-GBM队列中的RNA水平也证实了这种关联（图5g）。

比较CTRPv2数据中543种药物在培养中生长的GBM细胞的药物敏感性差异显示轴特异性敏感性和对多种药物的耐药性（图6a）。一些传统的抗癌药物（例如3-CI-AHPC、CD-437）仅在富含MYC的细胞系中显示生物活性。在KRAS轴激活的细胞显示出相反的结果，对靶向许多经典癌症靶点药物（例如，帕苄咪唑）具有相对抗性。基于MYC-KRAS轴的药物敏感异质性可能有助于解释KRAS富集肿瘤的临床侵袭表型，表明癌细胞可能需要不同的分析方法和细胞系来发现轴特异性治疗的方式。

在高氧和低氧浓度（21%和0.2%O2）下培养并分析患者培养的胶质瘤干细胞样（GSCs）细胞（图6b），然后进行Western blot分析证实缺氧标记物碳酸酐酶IX（CAIX）和AKAP12在缺氧72 h后呈时间依赖性激活，表明这些培养条件可以概括在该实验临床组织样本中定义的缺氧生态位。

在不同氧浓度的 GSC初始条件下分析它们对由188个激酶抑制剂组成的文库的相对敏感性（图6d），发现一些药物确实根据氧合水平显示出不同的反应（图6d）。例如，PDGFRB抑制剂仅在常氧条件下显著损害GSC活力，在缺氧条件下几乎没有影响（图6e）。相反，其他药物在缺氧条件下表现出更高的效力。总之，这些结果表明除了富集MYC和KRAS之外，微环境压力还可以驱动GBM区域生物学的动态变化，这可能减弱或改变其对治疗药物的敏感性（图6f）。

该研究利用空间蛋白质组将蛋白质组学模式覆盖到GBM的标志性组织形态学特征上，定义和验证一组有希望用于未来研究的区域标记，以及一个三轴模型，该模型捕获了肿瘤间和肿瘤内GBM异质性的重要和临床相关方面，为靶向异质性和克服治疗耐药性提供了见解。