项目文章Sci Transl Med | 中国医学科学院药物研究所花芳团队发现非小细胞肺癌治疗新机制

2023-12-21 11:00:21, 莲莲看 北京青莲百奥生物科技有限公司


肿瘤起始细胞(TICs)已被认为是肿瘤发生的驱动力,并被认为是复发、远处转移和耐药性的根源。新出现的证据表明,TICs表现出代谢可塑性,可以重新编程其代谢状态,以适应恶劣的微环境和生物合成需求。IDH1是异柠檬酸脱氢酶家族成员之一,在胶质瘤、胆管癌和急性髓样白血病等多种肿瘤中存在热点突变。目前已有多种小分子抑制剂获批或处在不同开发阶段,用于治疗携带IDH1热点突变的恶性肿瘤。随着对该靶点的关注,研究人员发现野生型IDH1(IDH1WT)在胶质瘤、肺癌等多种肿瘤中也能发挥重要的促癌作用。IDH1在非小细胞肺癌(NSCLC)中突变率极低,是非小细胞肺癌的独立预后因素,但IDH1WT如何调节非小细胞肺癌的恶性进展,以及IDH1WT是否依赖于其酶活性发挥促肿瘤功能仍未可知。

2023年12月13日,中国医学科学院/北京协和医学院花芳教授团队在国际顶级期刊Science Translational Medicine  ( IF 17.1 ) 在线发表题为“Wild-type IDH1 maintains NSCLC stemness and chemoresistance through activation of the serine biosynthetic pathway”的研究成果,该研究发现IDH1WT通过激活丝氨酸从头合成途径驱动TICs并促进NSCLC进展,研究结果表明IDH1WT的非酶作用是一种可药用的“代谢检查点”,可靶向治疗NSCLC。

青莲百奥为本研究提供蛋白质组学检测和分析服务。

文章标题:Wild-type IDH1 maintains NSCLC stemness and chemoresistance through activation of the serine biosynthetic pathway

发表期刊:Science Translational Medicine

影响因子:17.1

发表时间:2023年12月13日

研究思路

对细胞模型进行了mRNA、蛋白、代谢物三个层面表达分析,发现IDH1WT可能分别通过增加PHGDH蛋白质丰度和PSAT1 mRNA表达来调节丝氨酸代谢过程;

通过免疫共沉淀和荧光免疫显色及邻近连接分析(PLA)验证,发现IDH1WT通过与PHGDH和FXR1相互作用,阻碍了PHGDH和FXR1与E3连接酶parkin的结合,进而维持PHGDH和FXR1的稳定;通过链霉亲霉素D追踪实验和体外翻译实验确证了FXR1的堆积进一步维持PSAT1 mRNA稳定性并促进PSAT1翻译;

通过PHGDH活性检测、细胞代谢物检测、构建IDH1R314C突变体发现IDH1通过增强丝氨酸代谢和GSH/ROS失衡维持NSCLC干性;

针对IDH1非酶依赖的脚手架蛋白功能设计了一条可同时干扰IDH1—PHGDH和IDH1—FXR1相互作用的多肽PPH5。利用肺癌移植瘤模型实验发现遗传抑制IDH1或药物消除其支持丝氨酸代谢的作用可以阻止NSCLC的进展,并增强NSCLC对吉西他滨和丝氨酸/甘氨酸饥饿疗法的抗肿瘤效应。

研究结果

一、IDH1与NSCLC中的丝氨酸和甘氨酸单碳途径呈正相关

IDH1是一种在细胞代谢、表观遗传调控和氧化还原状态中发挥作用的关键酶。研究用三种细胞系中IDH1 mRNA的表达和蛋白质丰度表达情况来确定IDH1在NSCLC中影响哪种主要代谢途径,其中PC-9和A549细胞显示出显著较高的IDH1丰度,而NCI-H157细胞显示出微弱的内源性IDH1表达。因此,研究对对照(Ctrl)组或IDH1沉默(IDH1KD)组PC-9细胞中提取总代谢物并进行LC-MS/MS(图1A)。富集分析显示,与对照组相比,5-甲基四氢叶酸(5-MTHF)是IDH1KD PC-9细胞中与Ctrl PC-9细胞相比下降最显著的代谢产物(图1A和B);IDH1的敲除显著降低了PHGDH和PSAT1的表达,这两种关键酶参与丝氨酸从头合成(叶酸循环的上游)(图1E和F);在IDH1表达较高的组别中,“丝氨酸家族氨基酸代谢过程”和“丝氨酸代谢过程相关”基因特征富集(图1G)。定量聚合酶链反应(qPCR)分析显示,IDH1沉默降低了PSAT1的mRNA表达,但没有降低PHGDH的mRNA表达(图1H);对照TCGA,在mRNA水平上观察到IDH1和PSAT1之间呈正相关,但在IDH1和PHGDH之间不呈正相关。参照人类NSCLC组织的免疫组化结果,在蛋白质水平上观察到IDH1和PHGDH之间以及IDH1和PSAT1之间呈正相关(图1M)。这些数据表明,IDH1可能分别通过增加PHGDH蛋白质丰度和PSAT1mRNA表达来积极调节丝氨酸代谢过程。

图1:IDH1的表达与NSCLC中的丝氨酸和甘氨酸单碳途径呈正相关

二、IDH1与PHGDH相互作用,阻碍E3连接酶parkin介导的PHGDH泛素化和降解

通过免疫共沉淀和荧光免疫显色发现PHGDH和IDH1在NSCLC细胞中存在内源相互作用(图2C和D);IDH1的过表达能够减弱PHGDH与parkin(E3连接酶)的相互作用及共定位(图2E),但不影响PHGDH和RNF5(E3连接酶)的相互作用。

研究通过邻近连接分析(PLA)验证了IDH1对PHGDH-parkin关联的干扰(图2,F和G);通过构建构建绿色荧光蛋白(GFP)标记的PHGDH的缺失突变体,并进行共免疫沉淀,发现PHGDH的SBD2和C末端调控结构域(RBD)可以与IDH1共免疫沉淀(图2H)。这些数据表明,IDH1可能在空间上阻碍了parkin与PHGDH的结合,从而抑制parkin催化PHGDH发生泛素化(图2I);当K330突变为精氨酸(K330R)时,IDH1过表达就不影响PHGDHK330R的基础泛素化(图2J)。总之,这些数据表明IDH1阻碍了parkin-PHGDH的相互作用,并阻断了parkin-诱导的PHGDHK330的泛素化和降解。

图2:IDH1与PHGDH相互作用,干扰parkin诱导的PHGDH泛素化和降解

三、IDH1增强FXR1蛋白的稳定性,增进PSAT1 mRNA的稳定和表达

IDH1沉默能够降低PSAT1 mRNA的丰度(图1H);结合临床信息发现,高FXR1 mRNA丰度与癌症患者的低生存率呈正相关(图3C)。根据这一特点,研究从IDH1免疫沉淀物中,通过MS分析检测到包含FXR1在内的63个具有10多种独特肽的RBP(图3B);在癌症患者组织的胞质溶胶中也可以观察到FXR1与IDH1的共定位(图3F)。多方面数据表明FXR1是IDH1的结合伴侣,是一种IDH1调节PSAT1 mRNA稳定性的潜在RBP。

此外,通过使用PSAT1启动子萤光素酶报告系统实验和分析发现FXR1对PSAT1转录激活没有影响,IDH1缺失显著降低了PSAT1 mRNA的稳定性和蛋白质表达(图3J);在PC-9细胞体系中,用RNA免疫沉淀(RIP)测定以验证FXR1与PSAT1 mRNA(3′UTR中的近端)的结合(图3O),发现纯化的FXR1蛋白可以促进了PSAT1蛋白的产生(图3P);在NSCLC细胞中,FXR1与真核起始因子4F(eIF4F)复合蛋白相关(图3Q);使用生物素化的ARE1及其突变探针,发现FXR1与位于PSAT1 3′UTR的ARE1结合,介导eIF4F复合蛋白和PABPC1的募集以启动PSAT1翻译(图3R);IDH1缺失降低了FXR1蛋白的丰度,但不影响FXR1 mRNA的表达,这些数据表明IDH1增强FXR1蛋白的稳定性,以抑制PSAT1mRNA降解并诱导PSAT1翻译起始。

图3:IDH1促进FXR1介导的PSAT1 mRNA的稳定和翻译

四、IDH1抑制了parkin与FXR1的结合,以维持其蛋白的稳定性

IDH1有两种可能的方式在FXR1泛素化中发挥抑制作用。首先,IDH1可能与E3连接酶相互作用,阻碍其与FXR1的结合;其次,IDH1可以与FXR1相互作用以阻止E3连接酶结合。为了研究IDH1是通过哪种方式在FXR1泛素化中发挥抑制作用,研究先通过Co-IP分析证明parkin是介导FXR1泛素化和降解的E3连接酶(图4A和B),且通过构建GFP标记的FXR1的缺失突变体及共沉淀分析发现FXR1的Agenet 1(AG1)结构域介导其与parkin的相互作用(图4F);为了鉴定FXR1中的parkin依赖性泛素化残基,将AG1和相邻AG2结构域中的赖氨酸残基突变为精氨酸,发现当赖氨酸K21突变为精氨酸时(K21R),parkin过表达不能再促进FXR1泛素化(图4K)和蛋白质降解;此外,IDH1过表达不能减弱FXR1K21R的基础泛素化(图4L)。基于这些结果,研究确定,IDH1阻碍了parkin-FXR1的相互作用,并阻断了parkin诱导的FXR1K21泛素化和随后的蛋白酶体降解。

图4:IDH1干扰parkin诱导的K21泛素化和随后的FXR1降解

五、IDH1通过增加PHGDH和PSAT1蛋白丰度来增强丝氨酸从头合成

研究通过PHGDH活性检测(图5A和B)、细胞代谢物检测(图5C/E/F/G/H)的方法,表明IDH1增强了丝氨酸和甘氨酸的从头合成。另外研究也用一组非NSCLC细胞中的IDH1的表达(图5K至Q)验证了这一结果,并发现IDH1介导的丝氨酸代谢激活可能与其他癌症类型具有广泛相关性。

限制食用丝氨酸和甘氨酸已成为癌症的一种潜在治疗方法。然而,大多数癌症细胞可以通过激活内源性丝氨酸合成来适应丝氨酸饥饿。研究用丝氨酸/甘氨酸饥饿(SG-w/o)对细胞的增殖影响来探索IDH1的缺失是否可以显示出丝氨酸/甘氨酸限制的协同肿瘤抑制作用,结果显示SG-w/o不显著抑制对照PC-9细胞的增殖,而IDH1敲除使PC-9细胞显著易受丝氨酸/甘氨酸剥夺处理的影响(图5R)。这些数据表明,IDH1缺失阻断了从头丝氨酸合成,并通过降低PHGDH和PSAT1蛋白丰度使癌症细胞对丝氨酸/甘氨酸限制敏感。

图5:IDH1增强了丝氨酸的从头合成

六、IDH1增强丝氨酸代谢,不依赖于IDH1酶活性

作为一种异柠檬酸脱氢酶,IDH1催化异柠檬酸的可逆氧化脱羧反应产生α-KG。研究构建了与IDH1WT一样的IDH1R314C突变体,通过PHGDH和FXR1的半衰期(图6D),表明IDH1以不依赖于酶的方式维持PHGDH或FXR1蛋白的稳定。基于UPLC-MS的代谢组学进一步评估了IDH1WT的代谢效应,发现与Ctrl PC-9细胞相比,IDH1KD和补充了α-KG的IDH1KD在叶酸代谢和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢中均代谢产物均减少(图6G)。同样,与对照组相比,用IDH1WT或IDH1R314C突变体过表达的NCI-H157细胞显示出甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢的改变(图6H)。使用PHGDH活性检测试剂盒,在NCI-H157细胞中过表达IDH1WT和IDH1R314C突变体都显著增加了PHGDH活性(图6I)。此外,用U13C6-葡萄糖追踪丝氨酸合成,过表达IDH1WT或IDH1R314C突变体的细胞都显示出从头丝氨酸合成的显著增加,如[M+3]-标记的丝氨酸的积累所示(图6J)。总之,这些结果表明IDH1以独立于其酶活性的方式调节丝氨酸生物合成途径。

图6:IDH1不依赖于IDH1的酶活性而增强丝氨酸代谢

七、IDH1通过增强丝氨酸代谢和GSH/ROS失衡维持NSCLC干性

细胞外丝氨酸的摄入和细胞内丝氨酸的合成对于癌症干性的开始和维持至关重要。为了深入了解与IDH1相关的NSCLC干性及其对PHGDH、PSAT1和FXR1的调节,研究分析了胚胎干细胞(ES)相关信号四个基因的富集情况。ES1信号在高IDH1、高PHGDH、高PSAT1或高FXR1组中强烈富集(图7A);PC-9和A549细胞中的IDH1敲低减弱了核心多能性因子的表达,如NANOG、c-MYC、八聚体结合转录因子4(OCT4)、SRY-box转录因子2(SOX2),和Kruppel样因子4(KLF4)(图7B)。在IDH1处理的不同细胞模型中,只有WNT信号传导的下游靶基因c-MYC和细胞周期蛋白D1显示出与GSEA分析一致的变化。总之,这些数据表明高IDH1激活WNT信号并维持NSCLC癌症的干性。

丝氨酸是GSH合成的底物,GSH合成对维持癌症细胞氧化还原平衡至关重要。研究发现PC-9细胞中IDH1的耗竭显著降低了GSH/GSSG比率,并诱导了活性氧(ROS)的产生(图7L、M);同样,IDH1WT或IDH1R314C过表达的NCI-H157细胞表现出GSH/GSSG比率增加和ROS产生减少;将ROS清除剂Naceyl半胱氨酸(NAC)添加到IDH1缺失的PC-9细胞中来评估IDH1是否通过诱导ROS失衡来调节癌症干性。由此得出IDH1丝氨酸轴诱导GSH/ROS失衡,并有助于CSC特性。

图7:IDH1通过增强丝氨酸代谢和诱导GSH/ROS失衡来维持NSCLC的干性

八、抑制IDH1使NSCLC对吉西他滨化疗敏感,对化疗和饮食丝氨酸/甘氨酸限制性治疗敏感

TIC被认为是耐药性的主要参与者。为了验证IDH1在丝氨酸代谢和NSCLC进展中的支架作用,该研究设计了包含PPH5在内的对PHGDH或FXR1的潜在干扰肽,用于靶向IDH1-PHGDH或IDH1-FXR1相互作用并进行验证,主要发现了PPH5处理PC-9细胞不仅破坏了IDH1-PHGDH,也破坏了IDH1-FXR1的相互作用(图8B),恢复了parkin-PHGDH和parkin-FXR1的关联(图8C)。通过皮下肿瘤模型证明了PPH5单剂治疗降低了肿瘤生长,PPH5与吉西他滨的组合显示出强大的抗肿瘤作用。这些数据证实,破坏IDH1在丝氨酸代谢中的支架作用是对抗NSCLC的潜在治疗策略,也是提高吉西他滨化疗敏感性的候选方法。

另外该研究也发现了用不含丝氨酸/甘氨酸的饮食和PPH5的组合饲喂小鼠,能够比单剂治疗有更好的效果,且PPH5与丝氨酸/甘氨酸饥饿相结合显著降低了核心多能性因子的表达。综上,数据表明,靶向IDH1支架作用使NSCLC对化疗和饮食丝氨酸/甘氨酸限制性治疗敏感。

图8:靶向IDH1支架作用及验证NSCLC对吉西他滨和丝氨酸/甘氨酸饥饿疗法的抗肿瘤效应

研究结论

该研究报告IDH1WT通过增强磷酸甘油酸脱氢酶(PHGDH)和磷酸丝氨酸氨基转移酶1(PSAT1)的表达,即新生丝氨酸合成途径的第一和第二个酶,来激活丝氨酸的生物合成。增加的丝氨酸合成导致谷胱甘肽/ROS失衡,并支持嘧啶生物合成,维持肿瘤起始能力并增强吉西他滨的化疗抗性,强调了IDH1WT作为根除TIC和克服NSCLC中吉西他滨化疗耐药的潜在治疗靶点。

青莲百奥合作文章

青莲百奥深度参与众多前沿研究,与中国医学科学院、中国科学院、军事医学研究院、国家蛋白质科学中心、四川大学华西医院等单位通力合作,累计发表SCI论文100余篇,累计影响因子(IF)800+,多项重磅文章问鼎Nature、Science Translational Medicine、Nature Communications等顶级期刊。

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