贺福初院士/丁琛教授等团队利用蛋白质组学揭示胃肠道间质瘤分子分型新视角

2023-12-27 10:51:28, 莲莲看 北京青莲百奥生物科技有限公司


胃肠道间质瘤(GIST)是胃肠道最常见的间充质肿瘤,转移率和复发率较高。目前,一些风险分层系统,包括美国国立卫生研究院(NIH)共识标准、修改后的NIH共识标准和世界卫生组织(WHO)共识标准,已被用于临床评估GIST的恶性潜能。风险分层系统中使用的主要变量包括肿瘤大小、位置和有丝分裂计数。然而,目前的风险分层仍然不足,探索分子亚型对改善GIST患者预后具有重要意义。

2023年11月,国家蛋白质科学中心&中国医学科学院贺福初院士以及复旦大学人类表型组研究院&复旦大学生命科学学院丁琛教授等团队合作于期刊Gastroenterology (IF=29.4) 发表题为“Proteomic characterization identifies clinically relevant subgroups of gastrointestinal stromal tumors”的研究论文,该研究利用蛋白质组学特征确定了胃肠道间质瘤的临床相关亚型,深度分析了GIST的蛋白-磷酸化组学特征,以了解GIST肿瘤生物学进程和治疗脆弱性。

文章题目:Proteomic characterization identifies clinically relevant subgroups of gastrointestinal stromal tumors

发表期刊:Gastroenterology

影响因子:29.4

发表时间:2023年11月

发表单位:复旦大学

研究策略

研究队列:193例未经治疗的 GIST FFPE样本(胃80例、空肠和回肠46例、十二指肠45例、食管12例、结直肠10例)及配对的127例患者的正常邻近组织(NAT)进行蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。随访时收集术后用药信息,共纳入150例未接受甲磺酸伊马替尼治疗的患者和43例术后接受甲磺酸伊马替尼治疗的患者。

验证策略:敲除和过表达SQSTM1/SRSF3细胞系、类器官transwell实验、染色质免疫沉淀、IHC染色、Western blot等。

图1 研究策略

研究结果

一、GIST队列的蛋白质组学景观

蛋白质组学分析共鉴定出14505个蛋白质,其中肿瘤和癌旁分别有13321和11973个蛋白质。磷酸蛋白质组学分析确定了71个肿瘤的3807个磷酸化蛋白,11443个磷酸位点及28个癌旁3012个磷酸化蛋白,8156个磷酸位点。蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据主成分分析结果显示肿瘤和NATs之间有清晰的界限,表明在GIST进展过程中出现了异常的蛋白质组学景观(图2A,E)。肿瘤和NATs之间共有3560个差异蛋白,其中2703个蛋白上调,857个蛋白下调(图2B,C)。

图2:肿瘤和癌旁蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析

通路富集分析表明,在肿瘤中高表达的蛋白在剪接体和间隙连接中显著富集,在磷酸化蛋白质组中也有相同发现(图2F,G)。而NATs中表达上调的蛋白在代谢相关的通路中富集(图2D),对于NTAs的磷酸化蛋白质组,富集途径与观察到的蛋白质不同,是通过PKC和MAPK调节Rho蛋白信号转导,激活GTPase活性和胃泌素-CREB信号途径(图2G)。此外,KIT和PDGFRA突变是GIST的关键驱动因子,蛋白组学结果发现这两种蛋白在肿瘤中均显著上调。

二、MAPK7 在GIST中通过磷酸化促进肿瘤细胞增殖

采用改良的NIH共识标准评估GIST复发的风险(极低/低危NIH_L;中危NIH_I;高危NIH_H),生存分析显示,NIH_H患者的无进展生存期(PFS)最差(图3A)。为了探索不同风险级别的GIST患者的蛋白质组学特征,在NIH分类中鉴定了显著差异表达的蛋白质(图3B)。其中NIH_L肿瘤的特征是富含局灶黏附和碳代谢的蛋白。NIH_H的特征是在剪接体和DNA复制途径中富集。NIH_I肿瘤表现为细胞外基质(ECM)和增殖蛋白的中间表达,其特征是在局灶黏附和剪接体途径中都富集(图3C)。磷酸化蛋白质组通路富集结果也显示,参与剪接体和DNA复制的蛋白质随着风险等级的增加而逐渐上调,表明细胞增殖途径激活可能与高风险GIST相关(图3D-G)。

图3:NIH分类的蛋白质组学分析

蛋白差异分析结果显示34个转录因子(TFs)/激酶与PFS呈负相关。其中10个蛋白(5个激酶和5个TFs)在NIH_H肿瘤中表达量最高。接下来,研究人员根据磷酸化底物的表达水平推断激酶活性,并确定了2个蛋白(MAPK7和CSNK1D)在肿瘤中表达水平和激酶活性升高,相关性分析显示只有MAPK7的表达与其激酶活性呈正相关(图3H-I)。揭示MAPK7可能在NIH_H GIST患者中发挥重要作用。构建过表达和敲低MAPK7细胞系,过表达MAPK7细胞系后激酶抑制剂处理、MAPK7敲低细胞系的野生型MAPK7载体转入等一系列细胞实验证实MAPK7 在 GIST 中通过磷酸化促进肿瘤细胞增殖的潜在作用。

三、不同位置GIST的蛋白质组学表征

GIST发生在食管(Es)、胃(St)、十二指肠(Du)、空肠和回肠(JI) 以及结直肠(Co)。为了说明不同位置的GIST肿瘤相似性及特异性,不同部位蛋白质组相关性分析发现Du和JI之间的相关性最高(r = 0.92),主成分分析也表明Du和JI可能具有更多相似的分子特征(图4A-B)。为了进行肿瘤位置的异质性分析,筛选5个位置显著差异表达的蛋白质(图4C),富集分析显示氧化磷酸化和TCA循环途径在Es中富集;St、JI和Co中显著富集代谢和ECM相关途径;Du显著富集ECM相关通路(粘着斑、紧密连接等),且肿瘤部位间的突变无显著性差异(图4D-E)。

图4:不同部位的胃肠道间质瘤的蛋白质组学特征

四、SQSTM1与GIST的药物敏感性相关

为了研究接受酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的靶向治疗(伊马替尼)不同预后患者的肿瘤分子差异,对其中43例术后接受甲磺酸伊马替尼治疗的患者进行生存分析表明未接受甲磺酸伊马替尼治疗,St与JI患者的PFS无差异,接受治疗后JI患者的生存率显著低于St患者(图5A,B)。差异蛋白分析显示St肿瘤上调的蛋白质在剪接体和DNA复制过程显著富集,而JI肿瘤中上调的蛋白质主要涉及与葡萄糖代谢相关的途径(图5C)。这些结果表明,葡萄糖代谢的上调可能会降低GIST对甲磺酸伊马替尼的敏感性。

图5:SQSTM1与GIST的药物敏感性相关

为了进一步探索St和JI 患者之间影响药物敏感性的不同机制,研究人员筛选了6个与药物敏感性相关的蛋白,其中SQSTM1与药物敏感性的相关性最高(图5D,E),免疫组化(IHC)染色进一步证实了SQSTM1在JI患者中高表达(图5F)。将接受治疗的患者分为敏感组和非敏感组,发现非敏感组的葡萄糖代谢相关蛋白表达上调,且SQSTM1在非敏感组中显著高表达,表明SQSTM1可能是影响GIST药物敏感性的关键分子。

五、GIST 患者的蛋白质组亚型分类

研究人员对150例未接受术后甲磺酸伊马替尼治疗的患者样本的蛋白表达进行了共识聚类,确定了4个亚型(图6A)。这些亚型的患者PFS存在显著差异,C1和C2患者预后较差(图6C),所有GIST位于胃的患者均位于C1和C3,位于十二指肠(93%)和空肠和回肠(100%)的GIST患者在C2(图6A,D)。富集分析表明不同亚型富集途径:C1:剪接体和ECM-受体相互作用;C2:代谢和ECM相关途径;C3:与蛋白质加工和RNA转运相关的途径;C4:与代谢相关的途径(图6B)。蛋白质亚型可以进一步将NIH_H或WHO_H亚型划分为不同的簇,完善复发患者的风险分层(图6D)。

图6:GIST患者的蛋白质组学亚型

接下来,对蛋白质组学亚型中的激酶进行了磷酸化蛋白质组学分析,确定了3个亚型的特征激酶,分别是C1中ATR和CDK1、C2中MAP2K1和RET以及C3中ARAF和BRAF。为了鉴定亚型特异性的药物蛋白,研究人员重点研究了71个在肿瘤中表达显著高于NATs的致癌基因,其中包括15个与PFS负相关的蛋白(图6E,F)。与其他亚型相比,SRSF3是唯一在C1中高表达的癌基因,免疫组化验证SRSF3在肿瘤中的表达高于NATs中,因此SRSF3可能促进C1患者GIST进展。

六、SRSF3通过增强氧化应激来促进GIST的进展

敲除和过表达SRSF3细胞系实验及类器官transwell实验也证实SRSF3能够增强细胞迁移和侵袭能力(图7A,B),TF分析显示MIER与SRSF3相关性最强(图7C,D)。染色质免疫沉淀测序证实了MIER1在调控SRSF3转录中的作用。为了确定SRSF3是否通过磷酸化增强细胞增殖,研究人员进行了相关性分析,发现PRKCD是唯一一个与SRSF3呈正相关的激酶,通过敲除和过表达SRSF3的细胞系实验进行蛋白质组、磷酸化蛋白质组分析表明,SRSF3通过激活PRKCD激酶活性促进GIST细胞增殖。

图7:SRSF3通过增强氧化应激来促进GIST的进展

与PRKCD活性相关的底物磷酸化水平中有3个磷酸位点也与SRSF3呈正相关,其中CYBA/T147与预后呈负相关,CYBA/T147磷酸化可以促进NADPH氧化酶复合物的组装以及活性氧(ROS)的产生,研究人员推测SRSF3通过影响氧化应激促进GIST增殖,通过对细胞模型中ROS水平测定等相关实验证明MIER1是SRSF3的上游调控转录因子,SRSF3的上调通过PRKCD介导的GIST氧化应激促进肿瘤细胞增殖。

此外,研究人员基于xCell算法的反卷积分析显示了来自不同部位的肿瘤之间存在不同的免疫浸润模式。为了进一步说明同一肿瘤位置免疫特征的异质性,将GIST患者根据免疫微环境分为4个预后差异的免疫簇,发现以T细胞(Im-I和Im-II)为特征的免疫簇的患者预后较好。

研究结论

该研究利用蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据来确定GIST的特征,强调了SQSTM1在降低GIST伊马替尼敏感性方面的重要性,可能提高了预测GIST患者对伊马替尼治疗反应的临床能力。此外,蛋白质组学分型可能有助于进一步细化患者复发的风险分层。

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