最新综述 | 基于质谱的体液蛋白质组学：未来已来

文章标题：MS-Based Proteomics of Body Fluids: The End of the Beginning

发表期刊：Molecular & Cellular Proteomics 

刊发时间：2023年5月

在过去的几年里血浆蛋白质组学发生了翻天覆地的变化，前处理的完善实现了血浆蛋白质组检测深度的大幅度提升，自动化推进了其快速检测。现在前处理已有完善的处理方案，全自动化或半自动化的液体处理机器人已得到广泛使用。样品制备过程也得到了简化，例如，通常用于在质谱分析之前所涉及到的蛋白质提取酶切等独立步骤，现在可以通过磁珠沉淀方法与酶切步骤进行合并，集成到全自动流程中。面对高丰度蛋白的挑战，除了常规的去除高丰富蛋白排除其信号干扰以达到检测低丰度蛋白的目的。还有通过具有特定表面化学结构的纳米颗粒也被用来选择性地富集低丰度的蛋白质。例如Seer平台基于磁珠富集的ProteoMiner蛋白富集试剂盒，当样本分成多馏分进行检测时，可以达到数千个血浆蛋白的鉴定深度。

随着性能更强且更稳定的商业化色谱柱的大范围应用，短柱与短梯度的新方法极大地增加了通量。商业化色谱柱现在可以持续以往10倍的时间，性能更稳定。与蛋白质组学中典型的nl/min流速相比，Sciex率先采用了流速较短的梯度，现在已广泛应用于各种平台。色谱柱的内径达1 mm，在μl/min的流速下，短梯度中可以产生良好的分离效果并且更加耐用，但需要更多的填料。极端情况下，经典HPLC色谱柱的梯度非常短，流速为mL/min，可在几分钟内完成整个测试，尽管这是以蛋白质组深度为代价的，但鉴于最近灵敏度的提高，这些方法正变得逐渐可行。特别是在血浆研究中，总蛋白量的受限比蛋白质组学其他领域要小。

近年来，数据独立采集（DIA）MS的成熟和广泛采用是一项标志性的里程碑。DIA技术对肽段离子的采样更加均匀，从而使数据更加完整，增强了蛋白质组的深度，并提高了灵敏度。因此，除了一些特定的工作流，如TMT标记，DIA在很大程度上取代了依赖性的数据采集(DDA)方法。DIA通常需要光谱库来匹配采集运行，算法的发展正日益减少对实验性库的需求，DIA技术已可以实现无建库的“direct DIA”。TMT(Tandem Mass Tags，TMT)体外同位素标记技术也是目前流行的质谱技术，采用多个（6-18）稳定同位素标签，特异性标记多肽的氨基基团，经高精度质谱仪串联质谱分析，能够同时比较多达18种不同样本中蛋白质的相对含量。TMT样品通常通过分馏分以实现高蛋白质组覆盖率，由于不同肽在报告通道中的串扰和复杂的衍生化要求，TMT的定量存在固有挑战，因此这种定量策略在常规临床中难以建立。对于大队列测量，DIA技术有着不可替代的优势。

针对非标技术检测有着高缺失值的问题，多路复用蛋白质组可以解决，但该技术限制了蛋白质组的深度。多重数据非依赖性采集（mDIA或plexDIA）技术的出现避免了这一限制。mDIA里引入一个参考通道(reference channel)可实现双倍蛋白质的鉴定和定量。通过匹配保留时间、离子迁移率和质量转移，参考通道中每个肽特征的轮廓被转移到目标通道上，产生需要整合信号以进行量化的精确区域。这种方法将鉴定和定量分离，增加了定量肽和蛋白质的数量，并大大提高了DIA蛋白质组学的可重复性和稳健性。mDIA工作流程与TMT工作流程相比，不存在压缩效应，利用数据非依赖性采集（DIA）技术，通过自动化和完整的二甲基化标记（二甲基化标记具有简单、可靠、成本效益高等优点）实现多重标记，以提高蛋白质组学的深度、通量和稳定性。mDIA在常规蛋白质组分析中保留了DIA的大部分优点，同时将通量提高了三倍。

与基于质谱技术的蛋白质组学相比，亲和结合技术在蛋白质组深度和样品通量方面一直处于领先地位。亲和结合蛋白质组学研究在几年前仅限于数百个样本，而在资金充足的情况下，对数以万计的个体进行人口研究也是可行的。这与基于质谱的蛋白质组学的几千个样本的通量形成了鲜明对比。

亲和结合的蛋白质组学方法有望实现更大的规模，并可能在未来几年解决目前对特异性的担忧。质谱在蛋白质组深度、样品通量以及定量和工艺方面的进一步改进方面也正朝着同样的方向发展。此外，质谱还适用于研究亲和技术难以触及的其他蛋白质组学方面。包括蛋白质的异构体、多肽和翻译后修饰。例如，分泌蛋白的糖基化是血浆蛋白的常见修饰，而血红蛋白的糖基化是监测糖尿病患者血糖水平的金标准，基于质谱的蛋白质组学很容易检测到这一点，但目前还没有亲和结合的测定方法。

随着性能更强且更稳定的商业化色谱柱的大范围应用，短柱与短梯度的新方法极大地增加了通量。商业化色谱柱现在可以持续以往10倍的时间，性能更稳定。与蛋白质组学中典型的nl/min流速相比，Sciex率先采用了流速较短的梯度，现在已广泛应用于各种平台。色谱柱的内径达1 mm，在μl/min的流速下，短梯度中可以产生良好的分离效果并且更加耐用，但需要更多的填料。极端情况下，经典HPLC色谱柱的梯度非常短，流速为mL/min，可在几分钟内完成整个测试，尽管这是以蛋白质组深度为代价的，但鉴于最近灵敏度的提高，这些方法正变得逐渐可行。特别是在血浆研究中，总蛋白量的受限比蛋白质组学其他领域要小。

近年来，数据独立采集（DIA）MS的成熟和广泛采用是一项标志性的里程碑。DIA技术对肽段离子的采样更加均匀，从而使数据更加完整，增强了蛋白质组的深度，并提高了灵敏度。因此，除了一些特定的工作流，如TMT标记，DIA在很大程度上取代了依赖性的数据采集(DDA)方法。DIA通常需要光谱库来匹配采集运行，算法的发展正日益减少对实验性库的需求，DIA技术已可以实现无建库的“direct DIA”。TMT(Tandem Mass Tags，TMT)体外同位素标记技术也是目前流行的质谱技术，采用多个（6-18）稳定同位素标签，特异性标记多肽的氨基基团，经高精度质谱仪串联质谱分析，能够同时比较多达18种不同样本中蛋白质的相对含量。TMT样品通常通过分馏分以实现高蛋白质组覆盖率，由于不同肽在报告通道中的串扰和复杂的衍生化要求，TMT的定量存在固有挑战，因此这种定量策略在常规临床中难以建立。对于大队列测量，DIA技术有着不可替代的优势。

针对非标技术检测有着高缺失值的问题，多路复用蛋白质组可以解决，但该技术限制了蛋白质组的深度。多重数据非依赖性采集（mDIA或plexDIA）技术的出现避免了这一限制。mDIA里引入一个参考通道(reference channel)可实现双倍蛋白质的鉴定和定量。通过匹配保留时间、离子迁移率和质量转移，参考通道中每个肽特征的轮廓被转移到目标通道上，产生需要整合信号以进行量化的精确区域。这种方法将鉴定和定量分离，增加了定量肽和蛋白质的数量，并大大提高了DIA蛋白质组学的可重复性和稳健性。mDIA工作流程与TMT工作流程相比，不存在压缩效应，利用数据非依赖性采集（DIA）技术，通过自动化和完整的二甲基化标记（二甲基化标记具有简单、可靠、成本效益高等优点）实现多重标记，以提高蛋白质组学的深度、通量和稳定性。mDIA在常规蛋白质组分析中保留了DIA的大部分优点，同时将通量提高了三倍。

与基于质谱技术的蛋白质组学相比，亲和结合技术在蛋白质组深度和样品通量方面一直处于领先地位。亲和结合蛋白质组学研究在几年前仅限于数百个样本，而在资金充足的情况下，对数以万计的个体进行人口研究也是可行的。这与基于质谱的蛋白质组学的几千个样本的通量形成了鲜明对比。

亲和结合的蛋白质组学方法有望实现更大的规模，并可能在未来几年解决目前对特异性的担忧。质谱在蛋白质组深度、样品通量以及定量和工艺方面的进一步改进方面也正朝着同样的方向发展。此外，质谱还适用于研究亲和技术难以触及的其他蛋白质组学方面。包括蛋白质的异构体、多肽和翻译后修饰。例如，分泌蛋白的糖基化是血浆蛋白的常见修饰，而血红蛋白的糖基化是监测糖尿病患者血糖水平的金标准，基于质谱的蛋白质组学很容易检测到这一点，但目前还没有亲和结合的测定方法。

矩形策略现在已经能够在多种体液中发现生物标志物。而特异性指示疾病的单一生物标志物是很少见的，因此作为生物标志物测试的是组合蛋白而不是单个蛋白。蛋白质组学通常会产生一组生物标志物，这些生物标志物单独情况下的差异倍数可能不大，但组合起来所捕获的体液蛋白组信息可解析多因素并准确诊断疾病状态。作者强调了蛋白质组合相比单一蛋白质分析物的优势，结合最近的经验进一步表明，这些panel通常由10到20个蛋白质组成，一起对患者进行分类。

在临床中，质谱蛋白质组学的非偏好性质使它非常适合于发现。不需要事先洞察或开发蛋白质特异性试剂避免了候选方法费时的建立和验证，而且不需要对疾病机制的先验知识或深入了解。随着技术的进步，如基于DIA的策略和越来越强大的质谱仪，将越来越多的目标纳入质谱分析的范围。之前由于鲁棒性、通量、重现性的问题使得质谱在常规临床诊断中的应用很少。但在过去几年中质谱取得了巨大的进步。例如，血浆蛋白质组可一分钟非靶向测量实现了COVID-19 严重程度的高通量和可靠分类。这一产量已经可以与临床实验室的常规质谱小分子分析相媲美，后者通常需要在几秒钟到几分钟内进行测量。在可重复性方面，全球多个学术实验室的日间非靶向蛋白质组测量显示，变异中位数系数低于20%。MS的分析过程兼容自动化和ISO规范质量管理。正如临床实验室使用质谱进行小分子测量所表明的那样，质谱在设置、操作、故障排除和分析方面也比免疫分析更加复杂。质谱分析的实际边际成本相当低，在某些小分子临床实验室环境下，甚至可以低至每个样本1美元。质谱还在一次运行中分析了许多分析物，这是现有ELISA检测方法所做不到的。在靶向质谱分析中也是如此，这种方法能够很容易地测量生物标志物panel中发现的典型蛋白质。与传统的ELISA或亲和结合技术相比，这种多路复用、高特异性和定量准确性是质谱的关键优势。

在临床实践中广泛需要绝对定量，即血浆中的pg/ml值或其一些替代值，以确保测量结果的可解释性、可追溯性和可转移性。MS中的这种绝对定量通常可以通过在工作流程中的某个点添加已知的掺入标准来实现。但完全严谨的标准化并不容易，而且前处理的可变性并没有得到消除。更普遍地说，绝对定量的概念最初并不严谨。例如，尿生物标志物/分析物常规地标准化为尿肌酐，以通过考虑肾脏中的水重吸收来确保可解释性。这表明绝对定量并不总是有意义的，其次，使用归一化和相对定量数据在临床实践已经被接受。体液蛋白质组学的经验表明，在某些情况下与绝对定量相比，体液蛋白质组的相对定量可能是一种更可靠和可解释的标准化措施。此外，它还具有很大的分析优势：将分析物与内源性蛋白质组相关联可以解释采样、储存、运输和处理步骤引入的变异。

从更广阔的角度来看，蛋白质组学领域还需要越来越多地关注非技术方面，包括开发与隐私保护法规兼容的基础设施以及与医学界进行更多的沟通。应共同选择生物标志物需求和合适的研究群体并优先考虑。临床用途必须明确定义并可操作，例如，通过干预引导治疗或改变生活方式。此外，所设想的生物标志物及其所引导的行动需要对患者和整个医疗系统具有良好的风险效益和成本效益比。当定义一种没有有效的治疗疾病的新分子亚型或诊断时，其难点在于生物标记物未被发现的情况下，不能对作用的益处进行研究。还有就是如果没有激励公司或医疗行业的参与者继续生物标志物候选，财务方面就会成为一个关键问题。要进行大规模的验证，需要以多中心验证的形式提供强有力的证据。此外，应用于常规临床将需要监管部门的批准，这是一个漫长而昂贵的过程。与临床实验室、公司、监管机构以及资助机构和报销机构的合作将是关键。

体液蛋白质组学的许多挑战现在已经被克服，许多研究已经在独立的队列中得到了验证。生物标志物虽仍集中在高丰度范围内，但也表明随着技术的进步正在将可检测的体液蛋白质组的边界推向较低丰度范围，还有更多的生物标志物等待发现。曾经的挑战已变为财富，基于质谱的体液蛋白质组学已做好准备走向未来。