解决中药入血后的微量代谢物鉴定难题——新思路：以延胡索为模型的研究案例

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研究背景

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前言

北京中医药大学药学院高教授课题组在Journal of Pharmaceutical Analysis发表的题为 “Corydalis Rhizoma as a model for herb-derived trace metabolites exploration: A cross-mapping strategy involving multiple doses and samples”（IF：14.026）的研究成果。研究以延胡索为模型，采用：分析高剂量草药提取物的代谢物，表征同一生物样品中临床剂量草药提取物的代谢物；基于不同生物样品中代谢物具有不同离子丰度的事实，应用不同生物样品的交叉图谱来鉴定微量代谢物两种方法。与不使用该策略相比，多检出44种临床剂量的草药提取物代谢物。这项研究提高了目前草药衍生代谢物表征方法的深度、广度和准确性。

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基本信息

延胡索作为草药衍生微量代谢产物探索的模型：一种涉及多剂量和样本的交叉映射策略

研究对象：延胡索

发表期刊：Journal of Pharmaceutical Analysis

影响因子：14.026

合作单位：北京中医药大学药学院、华西医院消化内科

运用生物技术：UPLC-Q-TOF/MS液质联用

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研究思路

图1. 延胡索生物碱代谢物鉴定所提出的分析策略汇总图

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研究方法

1.实验材料：

植物：延胡索；化学试剂：LC/MS级的水，甲酸、乙腈、甲醇；原阿片碱、延胡索乙素、四氢小檗碱、棕榈碱标准品。动物：雄性SD大鼠（200±10）。

2. 样本数量及分组：

2.1 大鼠分组：38只大鼠分三组，粪便和尿组（12）、血浆组（¼12）和胆汁组（14）。粪便组和尿液组大鼠分为6组，分别口服4个参考标准品（2.00 mL，20mg/kg）、临床剂量（0.56 mL）和大剂量（1.20 mL），分别采集12只大鼠给药前后24 h的粪便和尿样。血浆组：分组给药方式同上，收集13个时间点血浆样本。胆汁组：分组及给药同，另多有2只大鼠为空白对照。10%水合氯醛麻醉进行胆管插管，收集胆汁0-12h和12-24h样本。存于-80℃。

2.2 延胡索样品准备：研磨成粉过40目筛，将约20 g粉末在200 mL蒸馏水中浸泡1h，煎煮2次，每次30 min。合并提取液，最终溶解成40mL，相当于0.5g中药（药典中延胡索的临床口服剂量为3-10g/人，因此，延胡索的临床剂量为1.4 g/kg，即0.28g/大鼠（0.56 mL）。大剂量为3 g/kg，即0.6g/大鼠（1.2 mL)。

2.3 血液、尿液和胆汁样本的制备：样品解冻后，各时间点混合200 uL血浆。将适量的混合样品（血浆100 uL，尿液1 mL，胆汁150 uL）与三倍量的甲醇混合。涡旋30s后在4℃，12000rpm离心10min去除蛋白。上清液氮气干燥，70%甲醇复溶并离心15min，取上清液用于UPLC-Q-TOF/MS分析。

2.4 粪便样品制备：200 mg粪便在4 mL甲醇中涡旋30 s，放置1h。然后在4℃，12000rpm离心15 min，上清液用氮气干燥。甲醇复溶，离心15 min。上清液用于UPLC-Q-TOF/MS分析。

3. 采用的技术：

Waters UPLC Class液相系统联用Waters SYNAPT G2-SI MS质谱系统。采用MassLynx V4.1软件控制仪器并采集数据，UNIFI软件进行数据处理。其实验流程设计见图1。

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研究结果

母体药物和相关代谢物通常具有相同的骨架，其碎裂模式相似。为了更好地利用LC-MS技术对代谢物进行分析，有必要充分了解母体化合物的碎裂方式。延胡索生物碱主要分为四氢小檗碱、原小檗碱、原阿片碱和阿朴啡四种类型。

图S1. 四氢小檗碱的MS/MS谱及其特征性裂解途径

图S2. 延胡索乙素的MS/MS谱及其特征性裂解途径

如图S1和S2示，四氢小檗碱和延胡索乙素均有饱和C环，易发生RDA裂解，原阿片碱结构与四氢小檗碱相似，也易发生RDA裂解（图S3）。RDA裂解后通过进一步脱水形成最丰富的片段离子。而棕榈碱C环不饱和，极难形成RDA裂解（图S4）。酰胺基中存在弱键，因此阿朴啡型生物碱很容易失去（CH₃）2NH或CH₃NH₂取代基，产生最丰富的[M-45.0578]⁺或[M-31.0344]⁺片段作为特征离子（图S5）。

图S3. 原阿片碱的MS/MS谱及其特征性裂解途径

图S4. 棕榈碱的MS/MS谱及其特征性裂解途径

图S5. 海罂粟碱的MS/MS谱及其特征性裂解途径

选择四氢小檗碱、延胡索乙素、原阿片碱和棕榈碱并根据文献总结的母体代谢途径鉴定这些成分的代谢途径（图2）。四种具有代表性化合物的所有代谢物均列于表S1-S4（补充材料）。基于MS信息和标准品中总结的代谢途径，提出了MCFs来表征延胡索提取物的代谢产物（表1）。

图2. (A)四氢小檗碱、(B)延胡索乙素、

(C)原阿片碱和(D)棕榈碱的代谢途径

表1. 延胡索衍生代谢物的代谢特征片段（MCFs）

值得注意的是，研究发现延胡索生物碱的骨架在代谢过程中没有变化。因此，根据替代品的类型和数量以及体内代谢途径总结了化学结构筛选表（表2-4），为结构鉴定提供参考。表4. 原小檗碱化学结构筛选表（篇幅原因，此处只放表4，表2-3模式同此表）红色数字表示与延胡索代谢产物匹配的准分子离子。

4.1初筛中检测到的代谢物的鉴定：以临床剂量延胡索提取物血浆样品中的代谢产物MN-100为例说明了鉴定过程（图3）。在正离子模式下，准分子离子为m/z504.1881[M+H]⁺，化学式为C₂₅H₂₉NO₁₀。碎片离子m/z328.1548[M+H]⁺是葡萄糖醛酸化的代谢物，并在表2中检索到分子离子及7种对应的代谢物结构。表明MN-100与四氢小檗碱具有相同的骨架，在C2-C3位置有两个羟基取代，在C13位置有一个甲基取代，在C9-C10位置有一个葡萄糖醛酸和一个甲氧基。MN-100的质谱图及结构图如图4所示。

图3. 临床延胡索提取液给药血浆样品的色谱图

(A)m/z 504.1881的提取物离子色谱图

(B)血浆样品的总离子色谱图

表2. 四氢小檗碱化学结构筛选表

图4. MN-100的质谱和结构

4.2以高剂量延胡索提取物的代谢物为伪标准来鉴别临床剂量的方法：图5A中的代谢物MN-106由于丰度低、峰形差，在初筛中未检测到。然而，在相同的保留时间，高剂量血浆样品中的代谢产物MH-119被鉴定为甲基化和葡萄糖醛酸化的延胡索乙素。临床剂量和高剂量提取物的血浆样本中m/z 518.2028的EICs如图5A所示。在MS/MS谱（图5B）中，临床剂量提取物样品中的碎片离子响应值较低，几乎淹没在基线中，但具有与高剂量样品中相同的碎片模式，说明临床剂量提取物样品中也存在MH-119。

图5. 在临床剂量和高剂量提取物的血浆样品中

m/z 518.2028的提取物离子色谱(A)和MS/MS光谱(B)

4.3通过对不同生物样本的交叉定位，鉴定不同样品中的微量代谢物：同一生物样品在不同剂量下获得的代谢物几乎完全一致，因此该方法有助于对同一样品中的代谢物的鉴定。通过保留时间和m/z值，将一个样品中丰度较强的代谢物相应地映射到其他三个样品中，从而可以识别出不同样品中的微量代谢物。以临床剂量延胡索血浆样本中的代谢物MN-28和MN-29为例，说明该策略。如图6A和B所示，在不同剂量的血浆样品中，这两个峰的MS响应很弱。

图6. m/z 342.1715的提取物离子色谱图

(A)临床剂量血浆样本(B)高剂量血浆样本和

(C)临床剂量尿液样本

从高剂量到临床剂量的方法不能从血浆样本中识别，在尿液样本中检测到6种准分子离子342.1715[M+H]+的代谢物。在尿样的初筛结果中，保留时间分别为9.05 min和9.83 min的峰被鉴定为氢化四氢小檗碱。在m/z178.0859[M+H-C10H12O2]+处的片段离子反应表明其结构与四氢小檗碱相似，在表2中搜索了理论准分子离子m/z 342.1705，四氢小檗碱骨架的C-2、C-3、C-9和C-10处可能有3个甲氧基和1个羟基，表明氢化反应发生在A环，其结构及质谱如图7示。如图6A和B所示，从血浆样品中提取m/z 342.1715的离子，与在尿液中相同的保留时间内获得四个具有相同m/z值的色谱峰（图6C）。

图7. MN-28和MN-29的质谱和结构

4.4延胡索生物碱的结构与代谢的关系：延胡索生物碱的结构与代谢密切相关。去甲基化是最常见和频率最高的代谢反应。从图8可以看出，棕榈碱在甲氧基取代时最容易发生去甲基化，其次是延胡索乙素、四氢小檗碱和原阿片碱，甲基化反应则相反。其余的羟基容易发生硫酸盐化和葡萄糖醛酸化。葡萄糖醛酸化和硫酸化反应只发生过一次，而不是同时发生。只有两种代谢物被检测到被硫酸化两次。

图8.四个参考标准中代谢物类型的相对百分比

含亚甲基二氧基的组分会失去一个CO分子，而不含取代基的组分不会发生裂解，如延胡索乙素和棕榈碱的情况所示。原阿片碱类生物碱的五元含氧环和碳基易于氢化。前者变成一个甲氧基和一个羟基，后者变成一个羟基。羟基不稳定，容易发生脱羟基化。二羟基化在其他结构类型中没有发生。原小檗碱型生物碱由于不饱和C环而没有发生RDA裂解。因此，其结构难以确定，在代谢过程中非常稳定。棕榈碱只发生去甲基化和羟基化反应，代谢产物主要分布在粪便中，而不是分布在胆汁中，提示它可能是由肠道而不是肝脏代谢的。

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研究结论

研究采用不同样品和剂量的交叉组合，从临床标准剂量和从高剂量到临床剂量的策略中检测到127种代谢物。将化学结构筛选表与特征片段离子相结合，阐明了代谢物的结构。绘制了四种代表性标准品在大鼠体内更准确的代谢途径，并论证了延胡索生物碱的结构与代谢之间的关系。

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中药的体内代谢过程非常复杂，代谢物的结构多样化，这使其作用机制难以解释。因此，明确代谢物的结构对于证明药物的作用机制具有重要意义。比体外化学成分更丰富的结构代谢产物类型，将有助于寻找延胡索的生物活性成分。该策略在草药衍生代谢产物研究中具有优势。解决了生物样品基质响应高、代谢物浓度低、峰形不明显、MS/MS信息缺失等问题。本研究提出的策略将是发现药效学物质和代谢机制研究的有力工具。

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