肠道组织单细胞悬液制备

肠道是人体重要的消化器官，也是人体最大的屏障器官，与肠道菌群共生协调营养需求和免疫。肠道管壁由内向外依次为黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜层组成。黏膜由单层柱状上皮、黏膜固有层和黏膜肌层构成，小肠黏膜上皮和黏膜固有层向肠腔内凸起形成小肠绒毛，为小肠特有结构。

良好的肠道功能对于维持人体健康至关重要。临床上的肠道疾病表现多种多样，包括溃疡性结肠炎、结直肠息肉、结直肠癌等都有明确的生理或病理性改变。在肠道研究中，单细胞测序在细胞图谱构建、稀有细胞类型鉴定、发育、肿瘤微环境等方面均有所应用，肠道组织也是我们在单细胞测序样本制备中经常会收到的样本类型。下面就跟小编一起了解吉凯的专业单细胞团队是如何来针对肠道组织进行特定解离和消化的吧！

将人结肠组织样本分离成单细胞。

酶解液：

【A液】

2mg/ml  胶原酶 IV

1mg/ml  胶原酶 I

0.02mg/ml    DNA酶

5%  FBS

0.60%    BSA

30U/ml  透明质酸

10µM  Y-27632

HBSS

【清洗液】0.5% BSA的 PBS

（1）实验准备

样本接收，拍照留存，超净台紫外消毒、备好冰盒冰板，配制含0.5% BSA的 PBS清洗液;

（2）单细胞悬液制备

1）按上述配方配制酶消化液，过滤；

2）将样本组织倒入培养皿中，放置在冰板上，记录编号，拍照留存，加入清洗液，用清洗液清洗两次；

3）弃去清洗液后，向培养皿中加入少量消化液，用剪刀将样本组织剪碎；

4）将剪碎后的组织转入到离心管中，加入适量消化液；    

5）取20ul消化悬液进行台盼蓝染色镜检；

6）用封口膜将离心管封好，将样本放置在37ºC摇床消化1h；

7）用移液器吹打消化液，辅助消化；

8）消化结束后将悬液通过100µm,40µm滤网转移至离心管内，300×g离心5min；

9）弃去上层液体，加入红细胞裂解液轻柔吹散细胞，静置3min；

10）加入清洗液至终止裂红，300×g离心5min；

11）弃去上清，加入适量清洗液重悬混匀，分别取20µl进行AO/PI计数及台盼蓝镜检；

12）根据质检结果选择合适方案，去除杂质及死细胞；

13）加入清洗液清洗，300×g离心5min；

14）弃去上清，加入适量清洗液重悬混匀，分别取20µl进行AO/PI计数及台盼蓝镜检；

15）将质检结果反馈，等待上机。

人直肠癌样本

细胞活率：97.9%

活细胞浓度：1E+06/ml

人肠粘膜腺癌样本

细胞活率：96.48%

活细胞浓度：5.5E+05/ml