高分文章的利器——翻译组测序(Ribo-seq)

2023-06-08 16:10:57, Dr.WL 上海吉凯基因医学科技股份有限公司



翻译组测序是指对与核糖体结合的正在翻译的RNA片段进行测序,来准确获取样本中所有可翻译分子(包括mRNA和其他潜在可翻译RNA分子如lncRNA、circRNA等)的信息与精确定量。


Ribo-seq (Ribosome profiling sequencing)是最常用的一种翻译组测序技术,该技术利用RNA酶消化细胞中的RNA,得到被核糖体保护的正在翻译的RNA片段(ribosome footprints, RFs),然后对这些被核糖体保护的30nt左右的RNA片段进行富集、深度测序、分析。可获得全基因组水平的蛋白翻译效率,发现新蛋白/短肽,翻译组测序可以和转录组数据联合计算RNA的翻译效率,可以蛋白组的数据联合,通过分析瞬时翻译与蛋白累积的关系,分析蛋白的降解效应;翻译组测序是连接RNA和蛋白的桥梁。翻译组测序可以研究细胞内基因翻译的水平、区域、速率等,结合转录组、小RNA测序、蛋白组等进行关联分析,可以更精确地研究转录后调控、翻译调控机制。



翻译组测序最初是在酿酒酵母中研究,后来慢慢在很多物种中都有研究,但是比较多的还是动物,人和小鼠研究最多,植物相对较少。


Nucleic Acids Research, 2018, Vol. 46     

Ribo-seq 实验流程

一、消化组织/细胞,加入放线菌酮处理(主要是固定RNA-ribosome复合物);

二、使用RNA酶消化没有被核糖体保护的RNA;

三、富集被核糖体保护的正在翻译的RNA片段(ribosome footprints, RFs),30nt左右,哺乳动物大约28nt;

四、去除蛋白,去除rRNA;

五、建库+测序+分析。 


实验参数

参数详情

细胞样本

用Cycloheximide(吉凯提供)进行预处理,再液氮速冻寄送,≥1×107

组织样本

用含Cycloheximide的PBS清洗再液氮速冻,也可直接液氮速冻,≥300mg

测序平台

Illumina Nova Seq 6000

测序模式

SE50

测序数据量

30M reads

数据质量

Q20>90%,Q30>85%

P-site预测

符合高低低3nt规则分布

片段分布

20-40nt,主峰在28-30nt左右

Ribo-seq的数据分析

Ribo-seq数据呈现经典的3nt周期性分布

ORF预测

差异翻译基因火山图

差异翻译基因KEGG图


差异密码子使用频率

吉凯优势

rRNA的占比是Ribo-seq测序质量的一个关键指标,目前已发表的文章,甚至Cell上均显示rRNA占比较高,常规至少70%-80%,部分物种更是超过了90%,导致有效数据减少,数据利用效率降低,吉凯优势经过技术优化,大大降低了rRNA的占比。

样本类型

rRNA参数

参数详情

人胃癌组织

40%-51%

28-32nt

乳腺癌细胞系

46%-49%

小鼠睾丸

43%-50%

胶质瘤干细胞

42%-46%

小鼠肝脏

53%-55%

人源胚胎干细胞

37%-46%

甲状腺癌细胞

37%-61%

部分项目数据

Ribo-seq应用范围

1. 了解转录本上的核糖体分布、翻译活性;

2. 推测翻译起始位点、ORF位置;

3. 确定蛋白翻译效率;

4. 探究翻译调控和基因表达情况;

5. 和ncRNA联合,鉴定具有翻译能力的ncRNA,如:LncRNA/circRNA等。

Ribo-seq研究思路参考


1.实验技术干货

2.蛋白质组学研究

3.腺病毒简介及应用

4.临床基础研究思路解析    

5.组织特异性腺相关病毒

6.单细胞测序    

7.慢病毒实验操作指南

8.悬浮细胞专用病毒

9.靶点设计/数据库教程

10.测序技术研究与应用

11.非编码RNA研究技术与应用

12.腺相关病毒选择/应用    

13.表观遗传研究

14.文章解析

15.国自然课题设计思路解析

16.生物信息分析及工具      

17.外泌体研究    

18.肿瘤免疫研究

19.高分文章  

20.吉凯病毒神经方向应用案例 



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