FRONT PLANT SCI（IF:6.27）|植物转录组与代谢组联合探究：菱角参中苯丙烷和类黄酮生物合成相关基因

2023-05-25 19:47:08, 质谱创新组学上海欧易生物医学科技有限公司

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2022年7月，武汉工程大学王丽梅教授/课题组在Frontiers in Plant Science期刊发表的题为 “Integrative Analysis of theTranscriptome and Metabolome Reveals Genes Involved in Phenylpropanoid and Flavonoid Biosynthesis in the Trapa bispinosa Roxb. ”（IF：6.627）的研究成果，通过转录组和代谢组研究方法，鉴定了几种类黄酮途径的差异基因和差异代谢物，为未来研究控制菱角次生代谢产物合成候选基因的分子机制和功能提供了理论依据。

中文标题：转录组和代谢组联合分析揭示了菱角参中与苯丙烷和类黄酮生物合成相关基因

研究对象：菱角

发表期刊：Frontiers in Plant Science

影响因子：6.627

发表时间：2022年7月

合作单位：武汉工程大学食品科学与工程学院

运用生物技术：转录组学、代谢组学

研究背景

菱角作为重要的水生经济作物在世界范围内种植，目前对其研究主要集中在有效成分的分离和鉴定，以及对肿瘤的抑制作用上。但对次生代谢产物积累的分子机制的研究相对有限。因此，需要对转录组和代谢组进行综合分析，以确定关键的代谢途径和关键基因，并解释菱角的分子机制。

研究思路

研究方法

研究材料：菱角的根（RT）、茎（ST）、叶（LF）和壳（FR）

研究方法：转录组分析、代谢组分析

研究结果

1. 菱角的转录组测序和原始序列组装

利用菱角的根(RT)、茎(ST)、叶(LF)和壳(FR)提取总RNA构建cDNA文库进行测序。利用DNBSEQ平台进行双端测序，得到76.97 Gb的原始数据，从4个文库中获得4382万个原始reads。所有样本的Q20值均大于96.59%，Q30值均大于91.33%。使用Trinity对reads进行组装并剔除冗余数据后，FR、LF、RT和ST分别得到65,587、65,865、66,835和66,796个转录本。对所有样本的unigenes进行汇总后，使用RSEM剔除冗余数据，最终得到81,417个unigenes并对其进行功能注释分析，每个样本的N50都大于1710 bp。

2. nigenes的功能注释

将所有unigenes的注释结果与NR、NT、KOG、Swiss-Prot、Pfam、GO和KEGG等7个公共数据库进行比较，如表1所示。在所有数据库中注释的unigenes数量为35,895(44.09%)，而在至少一个数据库中注释的unigenes数量为74,514(91.25%)。此外，6903个unigenes未被任何数据库注释，表明它们可能是功能未知的新基因。

表1 | 不同数据库中关于菱角的注释细节

GO分类结果表明，在生物过程中有26,393个unigenes被注释为1,855个不同的GO项，在细胞成分中有33,246个unigenes被注释为540个不同的GO项，在分子功能中有44,294个unigenes被注释为1,619个不同的GO项。

图1 | 菱角的转录组的GO分类

图1描述了每个类别中排名前十位的GO分类，利用KEGG数据库对该基因进行分类和标注，进一步研究其功能。这些unique被分配到139条通路中，主要为是植物激素信号转导、RNA转运和植物-病原体等通路。KEGG分类中对其他次生代谢物的生物合成进行KEGG富集分析，发现与酚类化合物相关的79条代谢途径中富集了1235个unique，参与生物合成的unique有1067个。

值得注意的是，与酚类化合物生物合成相关的unigene表达水平在四种不同的组织中表现出组织特异性。与酚类化合物生物合成相关的特异基因在FR中的表达水平高于其他三种组织。这些发现表明，特定基因可能存在于不同的组织中，FR组织可能是酚类化合物生物合成的主要器官。

3. 简单重复序列的鉴定

利用MISA软件分析得到共获得18709份SSR序列。在这些ssr中，二碱基和三碱基重复序列的数量最多，单核苷酸数量主要集中在12-16个重复(1748个，89.14%)，双核苷酸数量主要集中在6-12个重复(8260个，96.53%)，三核苷酸数量主要集中在5-9个重复(6284个，96.14%)，这一发现表明，菱角的基因组可能是高度可变的。

图2 | 菱角基因组中SSR的分布

4. 实时荧光定量PCR验证RNA测序数据

利用qRT-PCR方法检测验证转录组数据的准确性。这些基因是从高表达基因池中随机选择的。qRT-PCR和转录组数据显示，这些unigenes表现出相同的模式。31个unigenes的qRT-PCR与转录组测序的相关系数为0.9739 (r² = 0.9739)。结果表明，不同组织中不同基因差异表达的转录组测序数据是可靠的。

5. 组织特异性基因分析

为了研究不同组织间的差异基因，在p<0.05的条件下，对不同组织进行两两比较。结果表明，FR和LF之间的DEG数量最多(9707)，而RT和ST之间的差异相对较小(2008)。此外，经统计分析，FR、LF、RT和ST分别有2098、1546、472和122个组织特异性单基因。FR组织特异性基因占总基因的49.50%，其中上调基因1623个，下调基因475个。对组织特异性的单一基因进行KEGG富集分析，发行FR在21个KEGG途径中显著富集，ST和RT分别只有3条和9条KEGG通路显著富集，LF中，15条KEGG通路显著富集。在与酚类生物合成相关的途径中，FR具有最特异的基因，其次是LF。在上述统计数据中，统计了与酚类生物合成相关的单基因数量。88个FR基因在酚类物质的生物合成中被上调，而LF只有8个基因被上调。这些数据表明，FR和LF是酚类物质含量差异最大的两个组织，FR可能是酚类物质生物合成的主要组织。

6. 酚类物质生物合成相关的基因差异表达分析

差异表达分析发现FR中具有组织特异性的单基因数为3658个(图3A)，其中2915个上调基因，894个下调基因(图3B,C)。KEGG富集结果表明，上调基因主要集中在苯丙素生物合成、类黄酮生物合成、苯乙烯类、二苯基庚烷类、姜辣素生物合成、黄酮醇生物合成等相关通路(图3D)。

图3 | 通过DEGs分析鉴定菱角FR中的特异性单基因

（A）每组中已识别DEG的维恩图

（B）仅在FR中上调的DEG的维恩图

（C）仅在FR中下调的DEG的维恩图

（D）仅在FR中上调的DEG的KEGG途径富集的统计分析

7. 代谢组学分析

本研究在FR和LF中检测到887个峰，相对标准差去噪后保留了793个代谢物。所有代谢物都含有高浓度的苯丙烷、脂质、萜烯、生物碱、类黄酮和木脂素（表2）。利用主成分分析法，观察各样本间的总体分布格局。PC1和PC2分别解释了57.9%和11.2%的样本间差异。PC1和PC2占样本差异的69.1%，表明PCA可以聚类不同组的样本(图4A)。热图聚类结果显示FR和LF之间代谢物含量存在显著差异(图4B)。这些结果表明，代谢组的检测是高度可靠的。

表2 | 菱角两个组织中鉴定的793种代谢物的类别

图4 | 差异代谢物分析

（A） PCA 3D 图

（B）基于层次聚类分析的热图

8. 差异积累代谢物的鉴定和富集分析

以VIP > 1 and |log2(FC)| > 1为标准进行筛选，OPLS-DA等的结果表明，该模型稳定可靠，可以进行后续研究。在这项研究中，筛选了来自FRvsLF组的202个DAM。火山图显示，116个DAM上调，86个DAM下调。KEGG富集分析显示，FRvsLF组的DAM在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、氨酰基-tRNA生物合成、类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成以及谷胱甘肽代谢中显著富集。

9. 转录组与代谢组数据的相关性分析

DEG和DAM的KEGG数据库富集结果表明，多个DEG和DAM在同一KEGG途径中富集（图5）。

图5 | 在同一途径中富集的DEG和DAM的KEGG富集分析

使用相关性分析来研究DEG和DAM之间的潜在调控网络。九象限图显示，多个 DAM 由多个 DEG 调节，或者单个 DEG 调节多个 DAM（图 6A）。此外，35个DEG与9个与DAM相关的黄酮类化合物显着相关。NAC家族基因Unigene17426与槲皮素、木犀草素等呈显著正相关（PCC > 0.90），与柚皮素查耳酮呈负相关（PCC < –0.90）（图6B）。

最后，参照KEGG数据库中的类黄酮生物合成途径，结合检测到的DEGs和DAM构建了FR中的类黄酮生物合成途径(图7A)，并测定了FR和LF之间该途径的基因表达和代谢物积累。从参与类黄酮生物合成途径的15个基因中共鉴定出55个转录本(图7B)。该途径表明，代谢物如eriodictyol、木犀草素和delphinidin在FR中显著积累，这可能解释了FR中较高的类黄酮浓度(图7A)。CHS、FLS、DFR、ANR、BZ1等7个deg上调，FR中也有7个deg下调，这可能与次生代谢产物复杂的调控过程有关。PGT1是FR及其其他组织中唯一下调的基因，可能与ST中黄酮醇的生物合成有关(图7B)。

这些发现表明，在次生代谢物的积累和基因表达水平之间存在复杂的调控网络。这些参与菱角中苯丙素和类黄酮生物合成的关键基因需要进一步的研究和验证。