蛋白分离纯化

无论蛋白质来源如何，许多原因可导致分离特定蛋白质非常困难。这些原因如下。

一，无通用特性可运用于蛋白纯化。利用核酸分子带负电荷的特性，带正电荷的硅基的选择性吸附技术可以纯化所有核酸。相反，蛋白质的分子特性差异很大。与DNA分子一步纯化不同，蛋白质纯化需要多步骤。

二，目标蛋白质含量极低。胞内蛋白种类成千上万，除某些看家基因产物外，大多数单一蛋白质的胞内含量低至忽略不计。常用的分析方法灵敏度低，仅质谱法极灵敏，但并非万能。

三，蛋白质无法扩增。痕量核酸可扩增至足量以便分析。相反，蛋白质只能通过实验启始时的过量表达，来保证在最后分析时，可以检测。

四，无法避免污染。质谱分析痕量蛋白时，常见中间丝蛋白及组蛋白污染。来自患者的样品污染尤为严重。这些样品附着血管，或正常组织混有病灶。样品中混有过量的脂质分子、血细胞和/或血浆成分。噪音杂蛋白含量大大高于靶蛋白。

五，蛋白质不稳定。无论在体内体外，蛋白酶会分解蛋白质;如果温度、pH及盐浓度不合适，蛋白质可能变性;假如缓冲条件不适，蛋白质可能聚集;蛋白质的半胱氨酸巯基可被氧化还原反应破坏。

蛋白分离

蛋白质理化的及生物学的不稳定性导致目标蛋白在实验过程中不可避免地丢失。解决上述问题的最佳方法是在实验开始时尽可能得到含最多的目标蛋白的生物材料。

对于含有大量细胞的固体样品，应进行组织匀浆和细胞裂解。如果是生物体组织样品，采用机械匀浆。裂解细胞可采用物理法，也可采用化学法，如使用去垢剂。在适当的缓冲条件下，去垢剂可大大增强蛋白质水溶性，提升提取效率。此外，离液剂，如尿素、盐酸胍、异硫氰酸胍等可拆解蛋白结构，提高蛋白的抽提效率。但离液剂需要高盐条件，后者会影响后续实验。除盐也会导致蛋白质损失。

对于液态样品，先要确定待分离的是可溶蛋白还是胞内蛋白。如果是提取胞内蛋白，先离心收集细胞。不同密度的离心介质可分离特定密度的特殊细胞。

从体液分离可溶蛋白类似于从固体样品分离细胞裂解液，可通过样品浓缩或沉淀进行蛋白富集。传统的盐析及热变性简便易行，盐析是通过高溶解性的盐竞争溶液的水分子，降低蛋白质的水溶性沉淀蛋白质。除盐析外，还可调pH值进行等电点沉淀。每种蛋白质具有特征性的等电点。往蛋白质溶液中滴加无机酸或三氟醋酸(TCA) ，目标蛋白会形成沉淀。此外，还可以使用多聚物或有机溶剂来促进蛋白沉淀。

选择蛋白分离手段，必须考虑到后续的蛋白分析方法。选用膜离心浓缩技术，可以一步浓缩蛋白质，但是，当蛋白质浓缩至较高浓度时，会引起膜堵塞，导致浓缩效率下降和蛋白质损失。

纯化及分析

从复杂混合物中纯化目标蛋白的方法很多，但制备层析纯化最常用。层析类型的选用取决于目标蛋白的理化特性。依据制备或定量分析，选用快速蛋白液相层析或高效液相层析。还可以选择下列层析或其组合：疏水作用柱层析，离子交换柱层析、分子棑阻层析及亲和层析。

如果仅需少量目标蛋白，可采用电泳技术。已知蛋白分子量，就可在电泳胶的相应位置，切割蛋白条带用于下一步质谱分析。通常 SDS-PAGE提供蛋白分子大小信息。如将等电聚焦胶条上样于SDS-PAGE，则是二维电泳，它提供蛋白质等电点和分子量信息。二维胶条的分辨率比一维胶条大大提高。

假如目标蛋白含量太少，可使用特异性抗体进行免疫印迹。抗体还可用于分离纯化蛋白。由于抗体结合的专一性，大多数最终产品都可以利用目标蛋白的抗体加以纯化。利用能结合大多数抗体分子的蛋白A偶联的或蛋白G偶联的琼脂糖凝胶，几乎所有抗体通过几轮离心就得到少量纯品。

酶联免疫吸附分析(ELISA)技术 是利用抗体的灵敏分析方法。无须纯化，ELISA可鉴别并定量目标蛋白。如果抗体足够，还可通过免疫组织化学或免疫荧光标记对机体组织及细胞中的目标蛋白进行定位及原位含量测定。

除抗体外，还可使用适配器，即特异性结合靶蛋白的核酸大分子研究目标蛋白。可通过SELEX，即指数富集配基系统进化技术筛选获得。由于极易化学合成，适配器将来会取代抗体。

近年来，液质联用越来越广泛用于靶蛋白鉴定，但质谱仅局限于定性分析。代谢标记在实验室受控培养条件下可定量。借助痕量靶蛋白的序列信息，代谢标记技术已成为精确可靠的蛋白质分析方法。最近，通过二维样本的质谱数据集成像或图谱成像，质谱成像(也称成像质谱)已成为直接检测组织或细胞特定区域蛋白质的有效手段。该方法仅凭观察组织细胞，就能原位探测靶蛋白的有无。也可在复杂情况下快速准确地探测特定生物标志物分子的有无。

蛋白质纯化实验室

蛋白质纯化实验室的要求无法准确制定，因为它们在很大程度上取决于被分离的蛋白质的类型和数量。为了涵盖所有可能发生的情况，有必要有一套设备来处理亚微米数量，另一套设备用来处理多微米数量——范围约为108！一个专门用于蛋白质纯化的实验室可能不需要小规模的设备，例如，如果它能处理总是大量可用的血浆蛋白质。另一个可能拥有最新的高性能设备，但无法（也不需要）处理超过几毫克的蛋白质。

如果假设不尝试数量上的极端，并且实验室正在处理各种蛋白质类型和来源，那么就需要某些基本的设备。获得起始材料并制备其提取物需要均化设备和离心机来去除不溶性残留物。当从组织或细胞的粗提取物开始进行初步分级时，需要不会被颗粒堵塞的设备和材料。第一步中使用的吸附剂和类似材料应该相对便宜，这样，当使用几次后性能下降时，由于不妥协的杂质堆积，它们可以丢弃。同样相关的是，在初始步骤中处理的数量比后面的步骤大；因此，试剂费用可能是一个重要的考虑因素。在第一个或两个步骤后，样品应足够清洁和清晰，以便使用高性能设备。

高效液相色谱法是一个具有多种含义的术语。对一些人来说，它只指反相色谱法；对其他人来说，它包括各种色谱法，只要设备是全自动的，并使用高性能吸附剂。Pharmacia Biotech推出了一种专门为蛋白质设计的高性能系统，称为快速蛋白质液相色谱法（FPLC），该系统使用标准蛋白质色谱法，如离子交换、疏水相互作用和凝胶过滤。在FPLC设计的基础上，可以使用更大的设备进行放大，这样实验室开发就可以快速转化为大规模生产。FPLC设计用于分离天然活性结构的蛋白质，而反相HPLC通常在吸附和洗脱过程中至少会引起短暂变性。反相高效液相色谱具有很高的分辨率，但它最适合于小于约30 kDa的肽和蛋白质。用老式低压吸附剂进行的色谱有时被称为“低性能”或“开柱”色谱；这两种描述都不一定准确。需要简单的馏分收集器和监测设备。该设备将用于更大规模的操作（数十毫克及以上的蛋白质），可能在方案的早期阶段使用HPLC。

AKTA FPLC

需要各种柱，既用专有吸附剂预填充，又空着进行自填充，其尺寸和类型取决于操作规模。几个阴离子交换柱（不同尺寸）、一个或两个阳离子交换柱和凝胶过滤介质，以及一系列替代吸附剂，如疏水相互作用材料、染料、羟基磷灰石、色谱聚焦和专业亲和介质，都是必不可少的。

设备齐全的蛋白质纯化实验室还应配备制备电泳和等电聚焦设备，以备其他技术无法提供足够分离的罕见情况。

除了实际分馏过程中使用的设备外，还需要各种其他项目。特别是，应该可以快速更换缓冲液，并轻松浓缩蛋白质溶液。这些操作需要透析膜、超滤膜和各种尺寸的凝胶排阻柱。

最后，需要对制剂进行分析和分析的设备。大多数此类设备在生物化学实验室中是相当标准的，包括分光光度计、闪烁计数器、分析凝胶和毛细管电泳设备、免疫印迹材料和免疫化学试剂。