顺铂纳米共轭物的合成、表征和多模式细胞内成像

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      本文报道了用于运输抗肿瘤药物顺铂的纳米载体合成，并使用表面增强拉曼散射光谱（SERS）和激光剥蚀-电感耦合等离子体飞行时间质谱仪（LA-ICP-TOF）的多模式成像技术观测和跟踪细胞对纳米载体及其中药物的吸收情况。

    自1978年顺式二氯二氨基铂（II），即顺铂药物获得批准以来，它一直是治疗实体瘤的主要金属药物之一。然而，由于该药物在临床上有一定的潜在毒副作用，科学界已将重点转向寻找其替代品或更具针对性从而减小剂量的给药方法。

      近年来纳米技术在这一领域有大量应用。纳米粒子（NPs）可以用作药物运输的有效载体，旨在选择性输送至肿瘤细胞并对药物优先吸收。近年来，已有各种辅助控制顺铂给药的纳米系统被报道，比如纳米聚合物、胶束、共轭物、树枝状聚合物、脂质体、纳米胶囊、金纳米粒子、铁磁性纳米粒子、二氧化硅纳米粒子等。为了确保这些纳米给药系统能够成功应用于临床应用，研究人员需要充分了解它们与传统给药系统的作用模式区别，因此需要在复杂的生物环境中（如细胞层面）跟踪这些给药系统，以便深入了解它们的吸收、药物释放和细胞内作用机理。

      SERS是肿瘤学领域重要的光学成像工具，具有亚细胞级分辨率和高灵敏度的分子靶向成像能力，因此SERS活性纳米载体已被用于顺铂的细胞内给药成像。SERS是一种非破坏性成像技术，可与X射线、超声波或核磁共振等成像方法结合使用，弥补其单一模式成像获得信息有限的缺陷。

      本文中，研究人员展示了由SERS和LA-ICP-TOF结合的多模式成像平台（图1）。这两种技术路线有很好的互补性，结合了SERS的分子特异性信息和LA-ICP-TOF的多元素信息，详细研究顺铂共轭物在细胞内的分布情况。SERS具有高空间分辨率，可以研究单细胞级别的药物吸收情况，LA-ICP-TOF可以快速同时检测多个细胞中的药物和纳米载体分布。这种多模式成像还有一个优势，它可以在未来的研究中利用小组之前发表的绝对定量模型来量化细胞内的药物浓度。

图1 顺铂共轭物SERS和LA-ICP-TOF多模式成像实验设计

      为了合成顺铂共轭物，研究人员基于其无毒性和生物相容性，选择了金纳米颗粒（AuNPs，也是一种常用的SERS衬底物）来合成顺铂共轭物。为了确保最佳的SERS增强能力，研究选择了40 nm粒径的金纳米颗粒。由于需要使用到两种成像模式，共轭物产物须有两种重要标记：SERS信号提供的拉曼标签以及LA-ICP-TOF信号对应的元素标签（金和铂）。将这两种成像模式结合后，就能同时确定药物和纳米粒子于细胞的相对位置。研究选择的拉曼标签是双炔烃分子（图1），它具有指纹峰（2212 cm^-1），在生物静默区域（1800-2800 cm^-1）不受细胞成分的背景干扰。炔烃标签被整合到一个有机框架内，分别通过羧基和苯胺基与顺铂和AuNPs连接。详细合成过程参见文章补充资料。成功将SERS标签链接到AuNPs表面后，通过ICP质谱仪表征，共轭样品中检测到2477±156 μg/kg的¹⁹⁵Pt，换算可得1 mL共轭物中顺铂含量为12.66 μM。通过消光光谱和粒子跟踪分析对所得的顺铂共轭物进行了表征，顺铂共轭物具有单模态特征，极少出现聚集体，平均模态尺寸为47±1.7 nm，数量浓度为5.6±0.2 *10¹³/kg。动态光散射和zeta电位测量证明了共轭物的短期稳定性。此外，还研究了它们在RPMI介质中的稳定性。尽管共轭物的总体稳定性一般，但轻微聚集并不影响它们在细胞内的吸收。

     研究人员将共轭物引入癌细胞环境，以便更好了解它们的作用模式。MCF-7乳腺癌细胞用共轭物处理48小时后，通过SERS和LA-ICP-TOF平台进行观察。SERS的三维成像中，X轴和Y轴以1 μm为分辨率，Z平面以5 μm分辨率采集，每个样品共采集5个Z平面，总范围为20 μm，选择2155-2280 cm^-1波长的总峰面积，重构生成SERS光谱，其中高强度像素对应2212 cm^-1处的炔烃峰。癌细胞的所有Z平面上都观测到了炔烃指纹峰，表明顺铂共轭物已经被细胞吸收，而不是在细胞膜上。用柠檬酸盐封闭的AuNPs对照样品则没有该高强度峰，说明2212 cm^-1信号峰来自炔烃而不是NP或细胞本身。

      为了进一步验证癌细胞对共轭物的吸收，研究还使用了10 μm空间分辨率的LA-ICP-TOF进行多元素成像，进一步证明了MCF-7细胞对顺铂药物的充分吸收（原文图3）。LA-ICP-TOF成像模式可以在每个瞬时激光脉冲事件中同时采集和研究多个元素信息。更具体地说，监测到的同位素 ³¹P、¹⁹⁷Au 和 ¹⁹⁵Pt，可分别与细胞、纳米载体和顺铂的存在相关。在细胞内（对应³¹P分布范围）同时检测到药物（Pt）和纳米载体（Au）即可证明药物的吸收作用。为了证明¹⁹⁵Pt信号与顺铂的存在有关，研究用AuNPs处理了MCF-7细胞的对照样本，结果显示没有顺铂存在。

图2 LA-ICP-TOF元素成像图（10微米空间分辨率）以及明场图。图中³¹P表示MCF-7细胞位置，¹⁹⁷Au表示纳米载体，¹⁹⁵Pt表示顺铂药物。颜色对应元素强度，³¹P：5-3000 counts；¹⁹⁷Au：20-15000 counts；¹⁹⁵Pt：5-80 counts。

      总之，这两种成像模式均证实了顺铂药物在细胞内的吸收情况，提供了详细的药物运输信息，在这种情况下，药物和纳米粒子可以作为独特的物种进行监测。SERS提供了更高的空间分辨率来研究单细胞的药物吸收，LA-ICP-TOF可以快速、同时检测多个细胞中的药物和纳米载体，通过两者结合，可以共同验证纳米共轭物在细胞内的吸收和定位。

      本文介绍了癌细胞的顺铂给药纳米载体的合成过程，证明共轭物成功地将顺铂输送到癌细胞内，将分子特异性、非破坏性的SERS和多元素成像的LA-ICP-TOF技术相结合的优势，可以详细研究顺铂在细胞内的去向。未来的工作包括定量研究¹⁹⁷Au和¹⁹⁵Pt在细胞内的定量模型，预计将进一步探索其药物输送的有效性和与传统顺铂治疗相比的毒性。

  这项工作的相关数据参考原文：https://doi.org/10.15129/b8043cc3-d526-4feaa3eb-c0027e866f3b。