代谢+蛋白多组学技术揭示CAR-T细胞免疫治疗白血病期间患者血液分子特征

CAR-T细胞治疗期间B-ALL患者的血浆蛋白质组学和代谢组学特征

●期刊：Clinical and Translational Medicine

●发表日期：2023.3.7

●影响因子：8.554

近期，华中科技大学同济医学院附属协和医院血液研究所及湖北省肿瘤疾病细胞治疗临床医学研究中心吴江华等人在“Clinical and Translational Medicine”期刊上发表题为“Plasma proteomic and metabolomic signatures of B-ALL patients during CAR-T cell therapy”的研究论文应用代谢组学及蛋白质组学技术揭示了CAR-T细胞治疗期间B-ALL患者的血浆分子学特征，旨在为CAR-T细胞治疗相关的不良事件和预后异质性提供了分子注释。迈维代谢为本篇文章提供代谢组学检测服务。

样本收集在不同的时间点从B-ALL患者中收集血样，Pre-FC代表在氟达拉滨/环磷酰胺(FC)淋巴细胞去除治疗前采集样本的时间点（Pre-FC，n =16），D0、D7、D14和D28代表在CAR-T细胞输注后第0、7、14和28天收集样品的时间点。峰值IL-6代表从IL-6水平处于峰值的细胞因子风暴患者(n = 13)中收集样品的时间点，其中8个样品在CAR-T细胞输注后的第7天和第14天获得。总共从B-ALL患者中收集了101份血浆样本。22名健康对照(HC)被登记用于比较。由于1例患者在出院后失访，使用了其余19例患者的数据进行预后分析。sCR代表在CAR-T细胞治疗后获得稳定完全缓解(CR)的患者；非CR代表CAR-T细胞治疗后未能达到CR或复发的患者。

该实验首先研究了B-ALL患者相对于HC的血浆蛋白质组特征。在这五组（Pre-FC与HC、D0与HC、D7与HC、D14与HC以及D28与HC）中分别有239、217、282、260和261个差异表达蛋白(图1A).大多数差异蛋白在B-ALL患者中下调，在肌动蛋白结合和肌动蛋白细胞骨架组织等方面高度富集(图1B,C)。B-ALL患者中上调的蛋白在急性期反应中占主导地位，在输注后第7天上调蛋白增多。参与调节脂质定位的蛋白质在输注后第14天上调，包括载脂蛋白C4、C-反应蛋白和分泌型磷蛋白1。代谢组学分析中，在这五组中分别发现了104、139、175、223和87种差异表达的代谢物(DEM )(图1D).在不同的时间点，DEM的富集途径不同(图1E)。在B-ALL患者中，DEPs和DEMs都富含自噬并下调。

B-ALL患者和HC患者之间血浆分子特征的显著差异，与治疗前样本相比，B-ALL患者的大多数DEPs在输注后第7天和第14天减少，并在细胞骨架组织的调节中富集。输注后第7天，在B-ALL患者中观察到上调的DEPs，这些上调的蛋白质在免疫效应过程、胶原代谢过程和标志性过氧化物酶体调节途径中富集。在代谢组学分析中，DEMs的途径富集揭示了组氨酸代谢、辅因子的生物合成、2-氧代羧酸代谢和氨基酸的生物合成在输注后第7天出现紊乱，而嘌呤代谢在输注后第14天出现失调。

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图1 B-ALL患者和健康对照者之间的血浆蛋白质组和代谢组的差异

通过共表达聚类分析(图2A–D)阐释CAR-T细胞治疗期间血浆蛋白和代谢物的变化。

全蛋白质组簇1 (WPC1)显示，富含异型细胞-细胞粘附正调节的蛋白质在CAR-T细胞输注后逐渐减少(图2C,E).在WPC2中观察到轴突延伸、分子内氧化还原酶活性和GTP酶活性的调节(图2A,C)，表明这些途径在CAR-T细胞治疗过程中受到抑制。在WPC3中鉴定出肌动蛋白细胞骨架组织(图2A,C,E)，表明细胞骨架组织被破坏。WPC4包含急性期反应，代表身体对CAR-T细胞感染的快速反应(图2C,E)。

代谢组学分析中，在整个代谢组簇1 (WMC1)中发现了甘油三酯高度富集在脂质和动脉粥样硬化、脂肪细胞中脂解的调节以及胆固醇代谢途径中(图2D)。高炎症状态下脂肪组织脂解可能导致血浆TGs水平升高。在整个代谢组簇2 (WMC2)中发现了游离脂肪酸和嘌呤代谢物(图2B)。在整个代谢组簇3 (WMC3)中观察到磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE )在逆向内源性大麻素信号和自噬等中高度富集(图2B,D,F)。

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图2 CAR-T细胞治疗期间蛋白质组和代谢组的时间分布图

研究细胞因子风暴(CS)患者和无细胞因子风暴(NCS)患者之间的蛋白质组学和代谢组学差异。与对照组相比，在五组中分别发现10、9、70、62和14个差异蛋白(图3A)。

在氟达拉滨/环磷酰胺淋巴细胞清除之前，CS患者中参与凋亡过程正调节的蛋白质显著上调(图3B-C)。在CS患者输注后第7天大多数DEPs上调(图3B-C)。CS患者在CAR-T细胞输注后第14天，载脂蛋白(即载脂蛋白C2 (APOC2)和载脂蛋白C3)上调(图3C)。

在代谢组学分析中，这五组中分别有23、60、103、152和24个DEM(图3D)。在CS患者输注后第7天，甘油磷脂代谢发生了显著变化(图3E)，CS患者的甘油磷脂水平较低(图3F)。在第14天的时间点，CS患者中DGs和TGs含量丰富(图3F)。与HC相比，在输注后第14天观察到CS患者的APOC2水平较高。载脂蛋白可能在输注后第14天调节TGs累积。与输注后第28天的患者相比，CS患者的许多代谢物(包括糖过磷脂和氨基酸)含量较低(图3F)，这表明CS可能导致这些代谢物的持久抑制。

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图3 细胞因子风暴(CS)患者和非细胞因子风暴(NCS)患者的血浆蛋白质组学和代谢组学

为了进一步阐明CS患者血浆蛋白质组和代谢组的动态变化，对CS患者进行了共表达聚类分析。由于IL-6在CAR-T细胞介导的CS中是一种关键的多功能细胞因子，本研究鉴定了能与IL-6协同共同参与上皮间质转化、谷胱甘肽代谢和色氨酸代谢的因子(图4A–D)，进一步揭示了组织重塑、代谢重编程和IL-6之间的潜在调节串扰。参与凝固和抗凝固的蛋白质富集在三个不同的簇中(图4E).例如，细胞间粘附分子1和血管细胞粘附分子1由细胞因子激活的内皮细胞分泌且属于WPC1(图4E).IL-6调节胰蛋白胨代谢(图4F).同样，色氨酸、犬尿氨酸和犬尿烯酸水平在IL-6峰值时显著增加(图4G)。患有CRES患者具有极高水平的胰蛋白胨、犬尿烯酸和犬尿氨酸。犬尿烯酸通过拮抗α7-烟碱受体来调节认知和行为，暗示了CRES的潜在机制。

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图4 细胞因子风暴期间蛋白质组和代谢组的时间分布图

接下来，比较了sCR患者(在CAR-T细胞治疗后获得稳定完全缓解(CR)的患者)和非CR患者(CAR-T细胞治疗后未能达到CR或复发的患者)之间的蛋白质组学和代谢组学差异。与非CR患者相比，在五个组中分别发现44、16、19、42和68个差异蛋白(图5A).在在淋巴细胞去除之前，sCR患者的多种同种异体移植排斥蛋白(即β-2-微球蛋白、组织蛋白酶S、诱导型T细胞共刺激因子配体)下调(图5B,C)。sCR_D28和非CR_D28之间的DEPs在戊糖磷酸途径中高度富集，并在sCR患者中上调(图5B,D)。上调的戊糖磷酸途径为细胞增殖提供核苷酸和氨基酸，可能有助于免疫重建。与非CR患者相比，这五组中分别有26、15、3、6和4例DEMs(图5E).在淋巴细胞去除之前，树突状细胞产热丰富，其中许多差异蛋白在非CR患者中表达上调(图5F)。

进一步分析不同临床结果患者血浆蛋白质组和代谢组的纵向变化。两组中CAR-T细胞输注后均诱导了炎症反应，sCR患者和非CR患者中细胞骨架组织和肌动蛋白丝过程的调节分别下调。然而，在CAR-T细胞输注后参与脊髓小脑共济失调、磷酸戊糖途径和DNA代谢过程调节的蛋白质在非CR组中持续下降。在代谢组学分析中，CAR-T细胞治疗期间，这两个组中的通路逆行内源性大麻素信号、亚油酸代谢、癌症中的胆碱代谢和甘油磷脂代谢均下调。代谢物富集到的产热、鞘脂代谢、神经营养蛋白信号途径在CAR-T细胞输注后在非CR患者中持续减少。后续使用蛋白质和代谢物的相对丰度值来识别潜在的生物标志物，以对具有不同治疗反应的B-ALL患者进行分类(图5H–J).蛋白质组学结果揭示了活化的白细胞粘附分子(ALCAM)、vanin 1 (VNN1)和钙粘蛋白相关家族成员2 (CDHR2)在sCR患者中下调，区分sCR患者和非CR患者的准确性高(图5C,H)。此外，在CAR-T细胞输注后第28天，sCR患者胸苷磷酸化酶(TYMP)、凝血酶敏感蛋白-4 (THBS4)和钙调素-1 (CALM1)上调，并且在区分具有不同治疗反应的患者方面也表现出高准确性(图5D,I). ROC分析发现血浆代谢物PE(P-18:0-20:3)、肉碱C12:1和1-甲基鸟嘌呤可高度区分sCR患者和非CR患者(图5J).

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图5 人源化抗CD19-CAR-T细胞治疗的B-ALL患者预后的潜在生物标志物的鉴定

CAR-T疗法是近年来最有前景的细胞免疫疗法之一，这项技术已成功应用于多种血液恶性肿瘤的治疗。然而免疫相关的不良事件和预后异质性仍然是嵌合抗原受体CAR-T细胞治疗的主要障碍。本研究应用多组学检测技术对CAR-T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)期间患者血浆蛋白质和代谢物变化进行检测，为CAR-T细胞治疗相关的不良事件和预后异质性提供了分子注释。

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