Cell Metabolism(31.373)|秒懂转录组、蛋白组、代谢组和宏基因组的联合应用技巧

2023-04-28 10:12:54, 小迈 武汉迈特维尔生物科技有限公司


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 前言

非酒精性脂肪肝(NASH)是中国发病率最高的慢性肝病类型,且患病率仍在逐年上升,但目前在世界范围内尚无有效治疗NASH的临床药物。NASH药物开发的一个主要障碍是临床前研究难以转化为安全/有效的临床结果,最近的失败突出表明需要确定新的靶向途径。甘氨酸代谢的失调已成为NASH的致病因素和治疗靶点。



最近,西安交通大学的研究人员在"Cell Metabolism "期刊上发表了一篇题为"DT-109 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in nonhuman primates"的研究论文。该研究报道了三肽DT-109 (Gly-Gly-Leu)可以剂量依赖性地减弱小鼠脂肪性肝炎和纤维化。为了提高临床前研究转化的成功率,该研究开发了一个非人灵长类动物模型,其在组织学和转录上能模仿人类NASH。研究者应用转录组学、蛋白质组学、代谢组学和宏基因组学相结合的多组学方法,发现DT-109不仅可以刺激脂肪酸降解和谷胱甘肽形成,还通过调节微生物胆汁酸代谢,逆转非人灵长类动物的肝脂肪变性并防止纤维化进展。该研究为人类非酒精性脂肪肝的治疗带来了希望。


实验设计




研究结果


1DT-109以剂量依赖性的方式改善小鼠的NASH

构造小鼠NASH模型,造模成功后,饲喂不同剂量DT-109。发现DT-109治疗减轻了NASH饮食引起的肝肿大,导致肝重量和肝体重比呈现剂量依赖性下降,在450mg/kg/天时效果最为显著。与接受对照剂的NASH饮食小鼠相比,450mg/kg/天的DT-109治疗使肝-体重比降低了31.1%。相应的,DT-109治疗导致了循环转氨酶呈剂量依赖性下降,与接受药物的NASH饮食小鼠相比,450mg/kg/天DT109治疗后循环AST降低了34.2%,ALT降低了50.3%。通过大体形态学、组织学和生化分析还证实了肝损伤减少,肝肿大、脂肪性肝炎和纤维化减轻。脂肪变性的评分,总体NAS和纤维化评分降低。总之,这些发现表明,DT-109治疗剂量依赖性地降低了饮食诱导的NASH和小鼠肝纤维化,以450mg/kg/天为最有效的剂量。



2模拟人类疾病在非人类灵长类动物中建立NASH模型

为了建立一个高度可转化的NASH临床前模型,研究者设计了一种食蟹猴的饮食干预实验方法。选择20只猴子进行NASH饮食10个月后,肥胖指数、腹围、腰围、肝损伤(AST、高血糖和糖化血红蛋白)和高脂血症(LDL胆固醇、HDL胆固醇和TG)显著升高。肝脏组织学分析显示肝脂肪变性评分,小叶炎症,肝细胞膨胀,整体NAS和纤维化评分均显著增加。此外,对猴子肝脏样本进行了RNA测序,揭示了该模型和人类NASH的转录相似性,途径富集分析表明,NASH相关的潜在途径很相似。与NASH相关并与肝脂肪变性相关的关键基因,在猴子和人类NASH模型中表达趋势也很相似。



3DT-109在非人类灵长类动物NASH模型中逆转肝脂肪变性,防止炎症和纤维化进展

在建立完非人类灵长类动物NASH模型后,将猴子分为两组,一组接受150mg/kg/天的DT-109治疗,另一组作为对照。5个月后,两组猴子在体重、腹围和腰围方面没有发现显著差异。在血糖和循环脂质谱方面也没有发现显著差异。然而,通过循环转氨酶评估肝损伤显示ASTALP显著降低。此外,对照组肝脏形态学显示明显的淡黄色,经DT-109处理后淡黄色减弱。组织学分析证实,接受DT-109治疗的猴子肝脏脂肪变性评分、肝细胞气球膨胀,总体NAS和纤维化显著降低。总之,这些发现表明,DT-109通过逆转肝脏脂肪变性,防止炎症和纤维化的进展,改善了非人灵长类动物中已建立的NASH




4转录组学和蛋白质组学揭示了DT-109诱导肝脏脂肪酸降解和抑制促炎/纤维化反应

为了阐明DT-109改善非人灵长类动物NASH的潜在机制,研究者结合了转录组学、蛋白质组学、代谢组学和宏基因组学多组学的方法。首先,对在终点收集的肝脏样本进行了RNA测序。主成分分析(PCA)显示,DT-109处理的猴子肝脏转录组与对照组明显分离,DT-109导致575个DEGs显著下调,391个DEGs显著上调。前100差异基因分析显示,调节促炎、免疫反应、纤维生成和ECM重构的关键基因显著下调,而调节能量、FA代谢和胆固醇代谢的基因被DT-109治疗显著上调。通路富集分析显示,DT-109治疗诱导了与在人类和猴子NASH中发现的相反的反应。特别是,在NASH中被抑制的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢以及色氨酸代谢途径在接受DT-109处理的猴子肝脏中显著上调,同时FA降解途径上调。在NASH中上调的细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、趋化因子信号通路和ecm受体相互作用通路,在接受DT-109处理的猴子肝脏中被抑制,并下调局灶粘附和细胞粘附分子通路。NASH相关DEGs的热图进一步强调了DT-109对NASH期间调节FA和胆固醇代谢、炎症和纤维化的基因的影响。


随后,研究者对在终点收集的肝脏样本进行蛋白质组学检测,评估了DEG的变化在蛋白质水平上是否一致。结果将前100个DEG与相应的蛋白质进行比较,发现了显著的相似性。比较转录组和蛋白质组数据的通路富集分析显示了相似的结果,DT-109上调FA降解和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,而下调了趋化因子信号通路、黏附和ecm受体相互作用通路。


接下来,研究者使用组织学和生化方法证实了这些通路改变的结果。与FA降解途径的上调一致,油红O(ORO)染色在DT-109处理的猴子肝脏中显著降低,肝脏甘油三酯的生化分析证实降低30.1%。与趋化因子信号通路的下调一致,对NASH中活化巨噬细胞的标记物CD68的免疫组化分析显示出显著的降低。此外,与纤维化评分的降低相一致,肝脏中羟脯氨酸水平所代表的肝胶原蛋白含量显著降低。与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径的上调相一致,用DT-109处理的猴子肝脏中的GSH增加了3倍。因此,结合转录组学、蛋白质组学、组织学和生化验证表明,DT-109诱导FA降解,并抑制已建立NASH的非人灵长类动物的促炎和纤维化反应。




5非靶向和靶向代谢组学揭示了DT-109抑制胆汁酸代谢

为了进一步探索DT-109改善非人类灵长类动物NASH的代谢机制,研究者进行了非靶向和靶向代谢组学研究。PCA和OPLS-DA显示,接受DT-109治疗和对照组的猴子血清代谢组不同。通路分析显示,BA生物合成途径的富集最为显著,DT-109处理后循环BA总体减少。非靶向代谢组学显示,各种BAs显著降低,包括胆酸、糖去氧胆酸、牛磺酸去氧胆酸、熊去氧胆酸、糖去氧胆酸和牛磺酸去氧胆酸/鹅去氧胆酸。减少最显著的是次级BA,石胆酸(已知会引起肝毒性),以及甘氨酸和牛磺酸偶联物。


为了验证上述发现,研究者接下来对BAs进行了靶向代谢组学,证实在DT-109治疗的猴子中循环石胆酸显著下降。对BA组的分析显示,总循环BAs显著减少,而次级BAs的减少最为显著,在小鼠模型中也发现了类似的效果。总之,非靶向和靶向代谢组学显示,DT-109治疗降低了NASH期间的循环BA,其中次级BA和石胆酸最为显著。




6DT-109改变了与石胆酸相关的肠道微生物群

为了探索DT-109调节石胆酸代谢的潜在机制,研究者将非靶向和靶向代谢组学应用于肝脏和粪便样本,并结合了宏基因组学。PCA和OPLS-DA分析表明,接受DT-109和对照组猴子肝脏中的代谢组不同;途径富集分析发现,初级BA生物合成途径显著富集。然而,靶向代谢组学显示,总代谢水平无显著差异。


因此,接下来对粪便样本中的BA种类进行了综合分析。PCA、OPLS-DA和热图显示,DT-109治疗的猴子和对照组的猴子之间有明显的分离。石胆酸在粪便样本中浓度最高,经DT-109处理后显著降低。考虑到肠道细菌在前体CDCA经过7a-脱羟基化生成石胆酸过程中的关键作用,研究者接下来进行了16S RNA测序,评估了DT-109对肠道微生物组的影响。beta多样性分析显示,使用DT-109处理和对照组的猴子中有不同的微生物组成,主要在属水平上存在显著差异。


为了确定与NASH严重度和石胆酸代谢相关的细菌,研究者接下来评估了差异菌群NASH相关指标和肝脏石胆酸浓度之间的关系。志贺氏杆菌是一种先前报道的NAFLD和肝纤维化患者中较高的一个属,与血清AST、NAS、纤维化评分以及肝石胆酸呈最显著的正相关。相比之下,粪杆菌(一个主要由普粪杆菌组成的属),以其抗炎特性和降低小鼠肝脂肪变性的能力而闻名,与血清AST、NAS、纤维化评分和肝LCA呈最显著的负相关。这些发现表明,在NASH期间使用DT-109治疗可调节肠道微生物群,并与石胆酸代谢和NASH的严重程度相关。




7DT-109可抑制微生物产物-石胆酸(与人类NAFLD风险独立相关)

接下来,研究者试图确定DT-109是否通过调节肠道微生物群来抑制石胆酸(LCA)的产生。首先,通过独立的qPCR分析证实,在DT-109处理的猴子粪便样本中,产丁酸盐的一种粪菌显著增加,而志贺大肠杆菌显著下降。接下来,研究者使用同位素标记石胆酸的前体CDCA,评价DT-109对微生物生成石胆酸的影响。粪便样品与d4-CDCA孵育,两组添加或不添加DT-109处理,然后通过质谱法测量新生成的d4-石胆酸的水平。发现在小鼠粪便提取物中,DT-109剂量依赖性地减少了LCA的形成。


为了检验DT-109处理后增加的prausnitz粪杆菌是否可以抑制石胆酸的产生,将小鼠粪便样品与d4-CDCA孵育,并添加prausnitz粪杆菌或等体积的Gifu厌氧培养基(对照),监测新生成的d4-LCA,发现粪杆菌从孵育4小时开始显著降低了石胆酸的形成。对NASH猴子粪便样本中各种丁酸产生细菌的分析,发现DT-109处理显著且特异性地增加了粪杆菌的丰度,而没有改变其他产生丁酸的细菌。


最后,为了建立降低LCA的临床相关性,研究者对NAFLD患者(n = 149)与健康对照组(n = 229)进行了靶向代谢组学测量。NAFLD患者的循环AST和ALT水平显著升高,患者年龄较大,其中男性较多,血脂异常和高血糖加重。报告表明LCA与NAFLD的严重程度及其肝毒性呈正相关,和我们在非人灵长类动物中的发现(NAFLD患者的循环LCA显著增加)相一致。重要的是,调整后的年龄和性别,循环LCA与NAFLD风险呈正相关。在进一步调整甘油三酯后,LCA升高也被发现是NAFLD的独立预测因子,在进一步调整空腹血糖和高密度脂蛋白胆固醇后,相关性仍然显著。这些发现表明,DT-109调节肠道微生物群以增强prausnitzii粪杆菌,从而抑制LCA的产生,LCA是一种肝毒性BA,在NAFLD患者中增加,与NAFLD的风险独立相关。



研究结论

本研究结果表明,DT-109通过多种机制改善NASH,包括诱导肝脏FA降解和GSH生物合成以及调节微生物BA代谢,这与NASH的复杂发病机制和靶向多种途径的需要是一致的。总之,无论是单独治疗还是与其他候选药物联合治疗,DT-109在NASH中的治疗潜力值得临床评估。





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