单细胞代谢组专题 | nature子刊发表单细胞代谢组揭示肝癌NK细胞失活机制成果

2023-04-28 10:12:54, 小迈 武汉迈特维尔生物科技有限公司


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单细胞代谢组揭示肝癌中NK细胞失活机制

●期刊:nature immunology

●发表日期:2023.3. 23


迈博士有话说

本文是一篇单细胞代谢组学的文章,通过应用单细胞代谢组学发现NK细胞膜上鞘磷脂含量改变从而导致NK细胞与肿瘤细胞的结合能力下降,从而导致肝癌的进展。单细胞技术可以对分离出的特定细胞群体进行单个细胞的代谢组学检测,是近年来新兴起的一门代谢组学技术,可对肿瘤这种细胞异质性较高的样本类型进行更深入细致的研究,可为研究肿瘤的老师提供参考。


 导读

研究发现,相对于肝脏和外周正常NK细胞,肝癌患者瘤内NK细胞的膜突起的数量显著降低;而且这种膜突起缺失的NK细胞无法正常识别癌变的细胞,无法进一步形成免疫突触,因此丧失了抗癌的能力。研究进一步探究并揭示了NK细胞膜突起缺失的原因(采用单细胞代谢质谱技术),发现肿瘤的丝氨酸代谢失调导致瘤内NK细胞膜鞘磷脂(SM)水平下降,难以形成膜突起。而使用鞘磷脂酶抑制剂可促进NK细胞膜突起的形成,恢复NK细胞的抗癌能力。




摘要

免疫治疗的反应率变化大,具有很强的异质性,突显了我们对肿瘤如何操纵免疫细胞的知识有限。本研究中肝癌患者的自然杀伤(NK)细胞的膜拓扑显示,与肿瘤外的肝NK细胞和外周NK细胞相比,瘤内NK细胞具有更少的膜突起。这些突起的异常调节阻止了瘤内NK细胞识别肿瘤细胞,形成溶解免疫突触杀死肿瘤细胞研究发现,瘤内NK细胞细胞膜上的鞘磷脂(SM)含量发生改变肿瘤丝氨酸代谢失调,最终导致瘤内NK细胞鞘磷脂水平下降。抑制外周NK细胞中的SM生物合成与肿瘤内NK细胞的膜拓扑和细胞毒性的破坏相似。无论是作为单一治疗还是作为与检查点阻断的联合治疗靶向鞘磷脂酶可提供强大的抗肿瘤疗效


01
研究背景

免疫检查点现在被理解为介导肿瘤逃避免疫攻击的能力。这一认识支持了检查点阻断疗法的发展,如抗程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)和NKG2A免疫疗法,这些疗法在选择性地重新激活T细胞和自然杀伤细胞(NK)对肿瘤的反应方面是有效的,为许多癌症患者大幅延长无进展生存。然而,超过70%的癌症患者对检查点阻断疗法没有达到持续的治疗反应。许多研究已经检验了免疫检查点阻断疗法不同反应率的基础,现在很清楚的是,多种因素和复杂的免疫调节和代谢过程有助于不同程度的免疫逃避和各种肿瘤浸润免疫细胞亚群杀死肿瘤细胞的不同能力。


细胞毒性的诱导要求NK细胞接触其靶细胞并建立一个溶解免疫突触。先前的报道揭示了膜突起可能是免疫突触的一个组成部分。在这里,作者探讨了肿瘤内NK细胞膜拓扑结构的变化是否与溶解免疫突触的形成有关。


SM是细胞膜脂质的组成部分,而SM的从头合成已知依赖于丝氨酸代谢。有报道表明SM水平与CD8+T细胞裂解效应功能相关。作者研究了肿瘤内NK细胞溶解功能的中断是否与SM代谢异常和表面拓扑改变有关。


02
研究结果


1瘤内NK细胞膜突出量减少

导读:使用透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)NK细胞表面拓扑形貌进行研究,发现相对于正常肝NK细胞和外周血NK细胞,肝癌患者的肿瘤内NK细胞免疫突触更少。

作者的研究最初集中在NK细胞膜的拓扑结构上。使用透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)对从肝癌患者切除肿瘤中纯化的原发性NK细胞、从肝癌患者肿瘤外提取的肝NK细胞以及从正常供者外周血中分离的NK细胞的表面拓扑结构进行成像(扩展数据图1a、b)。肝NK细胞和外周NK细胞膜表面可见大量突起(图1a-c,e,f),突起长度为190 ~ 360 nm(图1d,g),直径为90 ~ 170 nm。有趣的是,从切除肿瘤中纯化的NK细胞的膜表面突起很少(图1a-c,e,f),且突起相对较短(40-130 nm)(图1d,g)。我们的TEM(图1b)和SEM分析(图1f,上图)一致观察到肿瘤内NK细胞特有的这些差异。作者还检测到从肺癌、结肠癌和卵巢癌患者中分离出的瘤内NK细胞的突起数量和长度也有类似的减少(扩展数据图2a-c)。


    

图1 a-d, TEM显示从肝癌患者切除肿瘤中纯化的NK细胞、从肝癌患者肿瘤外提取的肝NK细胞以及从正常供者外周血中分离的NK细胞的膜突出物。a、代表性TEM成像(中、下)和图形模式(上)。b,使用低倍率显微镜在一张图像中显示多个细胞。c,d,表示每个样品中膜突起的平均数量(c)和膜突起的平均长度(TEM) (d)。每个点代表一个样本。每组N = 10个样本。e-g,扫描电镜显示从肝癌患者切除肿瘤中纯化的NK细胞、从肝癌患者肿瘤外提取的肝NK细胞以及从正常供者外周血中分离的NK细胞的膜突出物。e,代表性的SEM成像。f,g,表示每个样品中膜突起的平均数量(f)和膜突起的平均长度(SEM) (g)。每个点代表一个样本。每组N = 10个样本。数据为平均值±标准差。数据采用双因素方差分析。比例尺,1 μm。


2肿瘤内NK细胞不能启动溶解免疫突触的形成

导读:将肝脏和外周正常NK细胞,肝癌患者瘤内NK细胞分别与癌细胞共培养,使用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM),发现肿瘤内NK细胞无法与癌细胞产生连接,无法形成免疫突触。 

多项研究在细胞激活过程中对T细胞的膜拓扑结构进行了成像,观察到的结构现在被称为“入侵样突起”或微绒毛;这些已涉及T细胞受体的定位和涉及抗原递呈细胞的过程。已知肿瘤内NK细胞具有非常低的识别和溶解肿瘤细胞的能力。为了研究观察到的NK细胞突出物的破坏是否介导肿瘤免疫逃逸,我们从切除的人肝肿瘤中纯化了新鲜的瘤内NK细胞,从邻近的非肿瘤肝组织中纯化了NK细胞,从正常供体中纯化了外周血NK细胞。这些不同的NK细胞与肝癌细胞(HepG2细胞系)共培养1-4小时(h)。低倍扫描电镜显示,几乎所有的肝NK细胞和外周NK细胞都与肝癌细胞结合(图2a)。与此形成鲜明对比的是,瘤内NK细胞的很大一部分(50-79%)没有与肝癌细胞结合(图2a)。在高倍扫描电镜下对NK细胞和HepG2/Huh7细胞的结合进行成像后,我们观察到肝脏NK细胞和外周NK细胞形成了紧密连接和免疫突触结构(图2b);然而,只有少数肿瘤内NK细胞与肝癌细胞结合,值得注意的是,即使结合的细胞也未能形成紧密连接或免疫突触结构18(图2b)。我们还使用TEM在×60,000倍率下对NK细胞和肝癌细胞的结合进行了成像,从而能够表征免疫突触的内部区域。我们发现肝脏NK细胞和外周NK细胞的膜突向HepG2细胞表面极化,清晰地构成了众所周知的免疫突触的形态(图2c)。瘤内NK细胞不与HepG2细胞接触;这些细胞也没有与HepG2细胞形成突起起源的紧密连接或免疫突触(图2c)。我们还使用细胞偶联物的免疫荧光共聚焦成像来评估f -肌动蛋白重塑、裂解颗粒极化和脱颗粒。我们发现肝脏NK细胞和外周NK细胞的f -肌动蛋白向HepG2细胞(靶细胞)表面极化,构成了众所周知的免疫突触形态。这些结果表明,肿瘤内NK细胞-显示中断的膜表面突出-不容易与肿瘤细胞形成接触,显然不能启动与肿瘤细胞形成免疫突触。


    

图2 a.扫描电镜显示人肝癌细胞与NK细胞结合。从肝癌患者(肿瘤及肿瘤外肝组织)及正常供体外周血中新鲜纯化的NK细胞与HepG2(肝癌细胞系)细胞共培养124 hHepG2细胞为黄色。NK细胞被标记为绿色。红色箭头表示未绑定的NK细胞。比例尺,10 μm。图()表示未与HepG2细胞结合的NK细胞占总NK细胞的比例。数据代表九个样本。b,c, SEM (b)TEM (c)显示人肝癌细胞与NK细胞的界面。从肝癌患者(肿瘤及肿瘤外肝组织)及正常供体外周血中新鲜纯化的NK细胞与HepG2细胞共培养124 h。左边的大细胞是HepG2细胞;右边的小细胞是NK细胞。该图显示了共培养中不与HepG2细胞结合的NK细胞的比例。每个点代表样本中非结合NK细胞的平均比例。数据代表每组5个样本。a-c, NK细胞在含有IL-15 (5 ng ml−1)IL-2 (100 U ml−1)的完全RPMI 1640培养基中培养。a,c,数据为平均值±s.dbc、比例尺,5 μm。数据采用双因素方差分析。


3瘤内NK细胞SM水平降低

导读:建立单个免疫细胞代谢质谱平台,对肝脏和外周正常NK细胞,肝癌患者瘤内NK细胞进行细胞膜、细胞内代谢物成分分析,发现肿瘤内NK细胞的鞘磷脂显著下降

当我们使用更高的TEM放大倍率(×100,000)对NK细胞膜的拓扑结构进行成像时,我们观察到与肝脏NK细胞和外周NK细胞相比,肿瘤内NK细胞的电子密度明显降低(图3a)。这一观察结果表明,肿瘤内NK细胞的膜组成可能与肝NK细胞和外周NK细胞的膜有显著不同。我们开发了一种基于质谱(MS)的方法来在单细胞水平上表征膜和细胞内成分。这种方法,我们称之为单免疫细胞质谱(sIC-MS),是在我们之前对诱导电喷雾单细胞msMS的研究基础上发展起来的。我们开发的诱导电喷雾单细胞质谱法已用于单细胞(例如神经元)细胞内化学成分的分析;简单地说,通过连接膜片钳和我们的单细胞质谱设置,细胞内容物被吸入采样移液管。在这种sIC-MS方法中,通过密度梯度离心从新鲜样品中分离出总免疫细胞,然后基于免疫磁珠技术分离出靶向的单个免疫细胞亚群(例如,NK细胞)(图3b)。使用开口为~1µm的微移液管通过施加负压进行细胞间液采样。在膜取样时,负压一直保持到细胞膜完全堵塞微管为止(图3b,左)。使用~1 μ m的微移管开口和持续负压有助于富集小尺寸(~5 μ m)的免疫细胞的膜内容物。随后,应用一系列高压脉冲实现分析物分子的电喷雾电离;注意,这些脉冲同时提供了将膜从微移管喷射到MS仪器(Orbitrap)入口的电势。因此,在sIC-MS分析的第一秒内,质谱显示了反映膜含量的信号(图3b(右,红线)),而在接下来的几秒内检测到细胞内的化学成分(图3b(右,蓝线))。


在对单个NK细胞的分析中,检测到多达42种膜成分,包括SMs、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和乳酰神经酰胺(图3c,e)。值得注意的是,我们能够在单个NK细胞中检测到7种不同的SM分子(图3c)。我们对来自不同来源的NK细胞进行的sIC-MS分析中最引人注目的发现是,与肝脏NK细胞和外周NK细胞的SM含量相比,瘤内NK细胞中的整体SM水平显著降低。具体而言,我们观察到瘤内NK细胞中5种SM分子(SM(d34:1)、SM(d38:0)、SM(d36:1)、SM(d36:0)和SM(d32:2)的水平与肝NK细胞和外周NK细胞相比显著降低(两种比较均P < 0.05)(图3d)。需要强调的是,我们观察到不同NK细胞在其他膜成分(PC、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和乳酰神经酰胺)水平上没有差异(图3e、f)。这些结果表明,与肝NK细胞和外周NK细胞相比,肿瘤内NK细胞膜的多重SMs水平显著降低。


    

图3 a.透射电镜显示NK细胞的膜拓扑结构。从肝癌患者(肿瘤及肿瘤外肝组织)和正常供体外周血中纯化NK细胞。对于每一组,呈现全细胞图像(左)和放大图像(右)。比例尺,1 μm。数据代表九个样本。b,从单个免疫细胞中提取膜和细胞内化学成分的sIC-MS方法示意图。在这里,一个NK细胞在显微镜下被识别,并使用注射器保持。膜内容物(红色空心环)在第一秒内被喷射到MS入口,随后是细胞内内容物(蓝色实环)。膜SMs (c,d)和其他脂质(PE,磷脂酰乙醇胺;PS磷脂酰丝氨酸;La,乳糖神经酰胺)(e,f)。d,f,数据为平均值±s.d。数据代表十个样本。数据采用双因素方差分析。f, P值见扩展数据图4g。


4NK细胞膜突起依赖于SM的合成

导读:对鞘磷脂合成酶进行抑制,采用单个免疫细胞代谢质谱技术发现正常NK细胞的鞘磷脂水平下降,同时扫描电镜和透射电镜下,正常NK细胞的突起减少,无法形成免疫突触。

接下来我们研究了NK细胞膜突起的形成是否与SMs有关。因此,我们通过已知的鞘磷脂合成酶的小分子抑制剂(D609)42和靶向编码该酶的转录本的小干扰RNA (si-SGMS1)处理24小时,降低了外周NK细胞(正常供体)的SM水平(图4a,c, sIC-MS;)。抑制SM合成可显著抑制NK细胞细胞膜突起的形成。具体而言,TEM和SEM单细胞水平分析表明,抑制SM合成后,膜突起的数量和长度都减少了(图4b, d-f, top)。此外,我们观察到外周NK细胞中SM合成的抑制会导致电子密度的降低(图4e,f,下)。


值得注意的是,SM抑制的外周NK细胞的表面拓扑结构与人类肝癌患者肿瘤内NK细胞的表面拓扑结构相似。因此,我们测试了sm抑制的NK细胞与肝肿瘤细胞(HepG2细胞系)形成接触的能力。扫描电镜成像显示,相对于未处理的外周NK细胞,SM抑制的NK细胞与肿瘤细胞形成紧密连接和免疫突触结构的能力明显降低(图4g,h)。这些能力的降低在动态观察中也很明显,这些分析显示SM抑制的NK细胞识别并与肝癌细胞形成接触的能力降低和HepG2的共孵育。TEM和CLSM清楚显示SM抑制的NK细胞不能轻易与肿瘤细胞表面形成接触,不能启动免疫突触结构的形成(图4i-l)。我们进行了体外实验,结果表明阻断SM合成降低了NK细胞裂解肝癌细胞和NK敏感靶细胞的能力(图4m,n);我们还发现阻断SM合成降低了抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。在成功建立人肝癌人源化小鼠模型的基础上,随后的体内实验14也表明,与未修饰的对照NK细胞相比,SM合成受到抑制的NK细胞的抗肿瘤作用较弱(图4o)。


    

图4  a,c,用sIC-MS分析D609 (a)或si-SGMS1 (c)处理的外周NK细胞膜SM含量。a,每组n = 7。C,每组n = 5。b,d,扫描电镜显示D609 (b)或si-SGMS1 (d)处理后外周NK细胞的膜突起。每组n = 6。比例尺,1 μm。e,f,透射电镜图像,显示D609 (e)或si-SGMS1 (f)处理过的NK细胞的膜拓扑结构。每组均呈现全细胞图像(上),并局部放大(下)。比例尺,1 μm。六个样本的数据具有代表性。扫描电镜(g,h)和透射电镜(i-l)图像显示HepG2和NK细胞之间形成的免疫突触。左边的大细胞是HepG2细胞;右边的小细胞是NK细胞。比例尺,0.5 μm。数据代表五个样本。用D609 (g,i)或si-SGMS1 (h,j)处理24 h后,NK细胞与HepG2细胞共培养4 h。m,n, HepG2细胞作为靶细胞,通过实时细胞指数测量(xCELLigence)与指示NK细胞进行细胞毒性实验。纯化NK细胞用D609 (m)或si-SGMS1 (n)处理24小时后进行细胞毒性测定。显示细胞溶解百分比(每组n = 4)。o,皮下注射HepG2建立人肝癌小鼠模型。纯化后的NK细胞分别用D609(25、100、400 μM)或si-SGMS1处理24 h。每组5只。a-o, NK细胞在含有IL-15 (5 ng ml−1)和IL-2 (100 U ml−1)的完全RPMI 1640培养基中培养。数据为平均值±标准差。数据采用双因素方差分析(a,b,k,m,n,o)和双尾未配对学生t检验(c,d,l)进行分析。


5丝氨酸代谢失调导致肿瘤内NK细胞SM水平下降

导读:对鞘磷脂上游合成进行通路分析,用单个免疫细胞代谢质谱技术检测,发现肿瘤细胞与NK共孵育时,共孵育的NK细胞丝氨酸-鞘磷脂通路(丝氨酸、鞘氨酰胺、二氢神经酰胺、鞘氨醇)受到抑制,胆碱-鞘磷脂通路(乙酰胆碱、胆碱和磷酸胆碱)不受影响。相比于外周血NK细胞和肝脏NK细胞,肿瘤内NK细胞丝氨酸和相关代谢物水平明显降低,PC或相关上游代谢物没有变化。


为了探索肿瘤如何降低瘤内NK细胞的SM水平,我们建立了一个由健康的外周血NK细胞和肝癌细胞(HepG2)组成的共培养系统。与单一培养相比,共培养体系中NK细胞突起的形成明显受到抑制(图5a)。此外,共培养的NK细胞显著降低了SM水平(图5b)。先前的研究已经证明了癌症中丝氨酸代谢失调,而丝氨酸是SM从头生物合成的前体代谢物。因此,我们使用共培养系统测量了丝氨酸水平:与单培养NK细胞相比,共培养NK细胞的丝氨酸水平(细胞外和细胞内水平)显著降低(图5c,d)。此外,我们发现在共培养的NK细胞中,与SM生物合成相关的其他代谢物(例如鞘氨酰胺、二氢神经酰胺和鞘氨醇)显著减少(图5d)。引人注目的是,我们还发现在共培养系统中添加丝氨酸可以挽救NK细胞突起的形成(图5e)。这些数据表明,NK细胞中丝氨酸的缺乏可以帮助解释在肝癌细胞存在的情况下培养NK细胞时观察到的SM水平降低和凸起形成的改变。我们还将共培养实验的这些结果与肿瘤内NK细胞和肝脏NK细胞联系起来。具体来说,我们发现肿瘤内NK细胞中丝氨酸和相关代谢物(如鞘氨酰胺、二氢神经酰胺、鞘氨醇)的细胞内水平明显低于肝NK细胞和外周NK细胞(图5f)。请注意,我们的RNA测序数据显示,鞘磷脂酶基因的表达在瘤内、肝脏和外周NK细胞中没有差异(例如,ASM、NSMASE1、NSMASE2、NSMASE3)(图5h)。在这三种类型的NK细胞中,SM生物合成功能基因的表达(例如,SGMS1, SGMS2)也没有任何差异(图5h)。最后,PC还可以作为SM生物合成的前体。因此,当我们的结果显示瘤内NK细胞与肝NK细胞或外周NK细胞相比,PC或相关上游代谢物(如乙酰胆碱、胆碱和磷酸胆碱)水平没有变化时,这是有信息的(图5g)。这些结果共同表明,在瘤内NK细胞中观察到的SM水平的降低(以及伴随的突起形成的破坏)似乎是由一些与癌细胞相关的丝氨酸代谢失调引起的。


    

图5 a,扫描电镜显示来自健康供体的外周NK细胞的膜突起。每组N = 5。b、单细胞质谱分析NK细胞中的SMs。每组N = 7。c、气相色谱-质谱联用分析培养上清中丝氨酸含量。每组N = 10。d,单细胞质谱法分析NK细胞中的丝氨酸、鞘氨酰胺、二氢神经酰胺和鞘氨醇。每组N = 10。a - e, NK细胞与HepG2细胞在Transwell设备中共培养,或单独培养。e,扫描电镜显示NK细胞的膜突起。NK细胞与HepG2细胞共培养,添加或不添加丝氨酸。每组N = 6。f,g,采用单细胞质谱分析肿瘤内NK细胞、外周NK细胞和肝脏NK细胞的代谢产物。每组N = 10。F,丝氨酸,鞘氨酰,二氢神经酰胺,鞘氨酰。G,乙酰胆碱,胆碱和磷胆碱。h,瘤内NK细胞、外周NK细胞和肝NK细胞基因表达的RNA测序分析。ASM,酸性鞘磷脂酶;中性鞘磷脂酶1;中性鞘磷脂酶2;中性鞘磷脂酶3;SGMS1,鞘磷脂合成酶1;SGMS2,鞘磷脂合成酶2。每组N = 3。a-e, NK细胞在含有IL-15 (5 ng ml−1)和IL-2 (100 U ml−1)的培养基中维持。a,e,比例尺,1 μm。数据为平均值±标准差。数据采用双向方差分析(e-h)或双尾非配对学生t检验(a-d)进行分析。FPKM,每千碱基的片段数,每百万的转录本。


6阻断SM分解代谢促进突起的形成SM分解代谢阻断和检查点抑制的协同抗肿瘤作用

导读:对鞘磷脂的分解过程进行抑制,用单个免疫细胞代谢质谱技术检测,发现肿瘤内NK细胞的鞘磷脂水平得到上调,同时电镜下观测到细胞的突起增加,NK细胞的抗癌能力得到恢复。进一步,同时阻断SM分解代谢(鞘磷脂酶抑制剂)和免疫检查点(tim3阻断抗体)的联合治疗,在体外实验、人源化肝癌小鼠模型中都可以提高NK细胞的抗癌效果。


先前关于SM的大量研究支持了SM代谢各个步骤的小分子抑制剂的成功开发。因此,我们能够使用酸性鞘磷脂酶抑制剂(a - smase抑制剂,LCL521)和中性鞘磷脂酶抑制剂(N-SMase抑制剂,GW4869)选择性地阻断NK细胞膜中SMs的分解代谢。我们在瘤内NK细胞实验中使用了这些药物,我们将其暴露于LCL521或GW4869(或载体)24小时。SM分解代谢阻断剂治疗瘤内NKs的sIC-MS分析显示SM水平显著升高(图6a,b)。值得注意的是,SM分解代谢阻断剂处理的瘤内NK细胞明显增加了膜突起的形成(图6c-e)。此外,阻断还增加了这些瘤内NK细胞的膜致密性(图6e)。与我们之前关于这些突起对NK细胞功能影响的观察一致,我们发现SM分解代谢阻断的瘤内NK细胞与未处理的瘤内NK细胞相比,识别肝脏肿瘤细胞和形成突起起源的连接和免疫突触的能力显著提高(图6f)。我们还证实,用这些SM分解代谢阻断剂治疗可显著增加瘤内NK细胞的体外肿瘤裂解活性(图6g)。我们证实,无论是NK细胞存活相关的细胞因子IL-2和IL-15,还是激活相关的细胞因子IL-12,都不能恢复膜突起的形成。这些结果表明,靶向SM调节了SM代谢,恢复了NK细胞的抗肿瘤活性。


我们在瘤内NK细胞中阻断SM分解代谢时观察到的这些显著的促肿瘤杀伤作用促使我们研究同时阻断SM分解代谢(鞘磷脂酶抑制剂)和免疫检查点(tim3阻断抗体)的联合治疗的潜在疗效。在肝癌患者中,流式细胞术检测NK细胞相关免疫检查点,结果显示肿瘤内NK细胞Tim3表达显著上调(P = 0.0373)(图6h)。Lanier团队先前的报道表明Tim3可能作为NK细胞毒性的抑制受体48。初步体外杀伤实验显示,与单一治疗相比,由GW4869与tim3阻断抗体(克隆F38-2E2)或LCL521与tim3阻断抗体组成的双重阻断组合显著增加了瘤内NK细胞的肿瘤裂解能力(图6i)。随后采用上述人源化肝癌小鼠模型进行体内实验,结果表明GW4869/ tim3阻断抗体双阻断联合治疗抗肿瘤生长效果优于任何一种单一治疗(图6j)。因此,除了证实SM分解代谢阻滞剂促进膜突出的结果可以促进瘤内NK细胞的体内肿瘤溶解能力外,这些结果表明,SM分解代谢的化学抑制剂在与免疫检查点靶向治疗联合使用时,可协同增加抗肝肿瘤的疗效。


    

图6  a,b, sIC-MS用于分析肝癌患者纯化的瘤内NK细胞的膜SMs。B,每组n = 9。c,d,扫描电镜图像,显示肝癌患者肿瘤内纯化NK细胞的膜突起。d,每个点代表一个样本。每组N = 6。c,比例尺,1 μm。e,显示瘤内NK细胞细胞膜拓扑结构的透射电镜图像。比例尺,1 μm。f, TEM图像显示HepG2细胞与瘤内NK细胞之间形成的免疫突触。左边的大细胞是HepG2细胞;右边的小细胞是瘤内NK细胞。比例尺,0.5 μm。每组N = 5人。g, HepG2细胞作为靶细胞,通过实时细胞指数测量(xCELLigence)与肿瘤内NK细胞进行细胞毒性实验。每组N = 6。a-g,瘤内NK细胞分别用GW4869 (1 μM)、LCL521(1 μM)或DMSO(对照)处理24 h。h,采用FACS技术检测新纯化的肝癌患者肿瘤内NK细胞和肝NK细胞中Tim3、PD-1、CTLA-4和NKG2a的表达。i,以HepG2细胞为靶点,通过xCELLigence对肿瘤内NK细胞的不同效应物进行细胞毒性实验。每组N = 6。分别用GW4869 (1 μM) +抗tim3阻断抗体(10 μg ml−1)、LCL521 (1 μM) +抗tim3阻断抗体(10 μg ml−1)、GW4869 (1 μM)、LCL521 (1 μM)、抗tim3阻断抗体(10 μg ml−1)和DMSO(对照)预处理瘤内NK细胞24 h。每组N = 4。j,通过皮下注射肝癌细胞(HepG2)建立人肝癌小鼠模型。纯化后的NK细胞分别用D609 (25,100,400 μM)或PBS(对照)处理24 h,然后用GW4869 (1 μM) +抗tim3阻断抗体(10 μg ml−1)、GW4869 (1 μM) +抗tim3阻断抗体(10 μg ml−1)或DMSO(对照)处理24 h。每组5只。a-j, NK细胞在含有IL-15 (5 ng ml−1)和IL-2 (100 U ml−1)的完全RPMI 1640培养基中培养。数据为平均值±标准差。数据采用双因素方差分析(b,d,f,g,i,j)和双尾未配对Student ''s t检验(h)进行分析。荧光激活细胞分选。


03
研究结论

在这里,来自肝癌患者的自然杀伤(NK)细胞的膜拓扑显示,与肿瘤外的肝NK细胞和外周NK细胞相比,瘤内NK细胞具有更少的膜突出。这些突起的异常调节阻止了瘤内NK细胞识别肿瘤细胞,形成溶解免疫突触和杀死肿瘤细胞。瘤内NK细胞细胞膜上的鞘磷脂(SM)含量改变,肿瘤丝氨酸代谢失调导致瘤内NK细胞鞘磷脂水平下降。外周NK细胞中SM生物合成的抑制复制了肿瘤内NK细胞被破坏的膜拓扑结构和细胞毒性。靶向鞘磷脂酶具有强大的抗肿瘤疗效,无论是作为单一治疗还是作为与检查点阻断的联合治疗。


04
科研延伸



                                      

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