Metabolism | 上海市五官科医院韦严团队发现表观遗传调节控制糖尿病视网膜病变进展的新机制

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病的一种严重并发症，目前是致盲的主要原因之一。研究表明大量活化的小胶质细胞和炎性巨噬细胞参与 DR 的发展。然而，由小胶质细胞/巨噬细胞驱动的适应性免疫炎症在 DR 中的作用尚不清楚。

Kdm6a 负责去除组蛋白 3 赖氨酸 27 (H3k27) 上的二甲基和三甲基基团，并激活靶基因转录。Kdm6a 与小胶质细胞/巨噬细胞之间的关系以及 Kdm6a 导致糖尿病视网膜病变的分子机制尚不清楚。

近日，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院/上海市五官科医院韦严副研究员为通讯作者，在内分泌领域权威期刊 Metabolism (IF: 13.934)在线发表了题为“Kdm6a deficiency in microglia/macrophages epigenetically silences Lcn2 expression and reduces photoreceptor dysfunction in diabetic retinopathy”的研究论文，发现了糖尿病视网膜病变小胶质细胞/巨噬细胞中的 Kdm6a 通过控制 Lcn2 的表达抑制光感受器细胞的糖酵解过程。

1、Kdm6a 在糖尿病视网膜病变中上调碍

通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）建立了糖尿病小鼠模型（图 1A-C），Kdm6a 蛋白和 mRNA 表达在糖尿病视网膜中升高（图 1D）。暴露于高糖条件下的小胶质细胞中 Kdm6a 表达也明显上调（图 1E-G）。并且小胶质细胞/巨噬细胞中 Kdm6a 缺乏可能减轻 DR 诱导的视网膜功能丧失（图 1H）。

2、Kdm6a 敲降可以降低体内外糖尿病视网膜病变的炎症反应

与对照相比，Kdm6a 条件敲除小鼠视网膜中蛋白 Tnfα 和 iNos 表达下调（图 2A）。高糖条件下特异性敲降 Kdm6a，可以导致 BV2 细胞中蛋白 CD11b 和 CD86 表达降低（图 2B-C），Il1β、Tnfα、iNos、Il6 mRNA 表达降低（图 2D）。特异性敲降 Kdm6a，可以促进 IL4 刺激的 BV2 细胞表面的 CD206 表达（图 2F），促进 Ym1、Il13、Il10、Arg1 mRNA 的表达（图 2E）。以上结果表明，Kdm6a 有助于 DR 中小胶质细胞/巨噬细胞的 M1 极化。

3、高糖通过 Kdm6a 依赖性调节增强视网膜小胶质细胞/巨噬细胞中 Lcn2 的表达

接下来，对高糖条件下的小胶质细胞/巨噬细胞进行转录组测序。与对照相比，Lcn2 是高糖刺激下上调最为明显的分泌蛋白基因（图 3A）。糖尿病小鼠模型中 Lcn2 的蛋白和 mRNA 表达也显著增加（图 3B）。结果表明，在 DR的小胶质细胞中 Lcn2 的表达增加。

对 si-Kdm6a 的 BV2 细胞进行转录组测序，结果显示 Lcn2 表达显著下调（图 4A）。si-Kdm6a 的 BV2 细胞中，高糖暴露诱导的 Lcn2 的表达并显著抑制（图 4D）。无论细胞是否暴露于高糖，si-Kdm6a 的 BV2 细胞上清中的 Lcn2 蛋白水平低于对照（图 4E）；相反，在 BV2 细胞中过表达 Kdm6a 可以显著促进 lcn2 蛋白和 mRNA 的表达（图 4F-G）。

由于 Kdm6a 作为针对 H3k27me3 的去甲基化酶发挥作用并上调靶基因，结果显示，Kdm6a 敲降显著增加了 Lcn2 启动子区域 H3k27me3 甲基化水平（图 4H），反之 Kdm6a 过表达降低了 H3k27me3 甲基化水平（图 4I）。

以上结果表明，Kdm6a 直接降低了 Lcn2 基因的 H3k27me3 修饰水平，并促进了 Lcn2 表达。

4、Lcn2 通过抑制糖酵解而破坏感光细胞的功能

IRBP 蛋白在视觉周期中起重要作用，对光感受器的维持至关重要；外周蛋白是视盘膜的组分之一。小鼠眼睛玻璃体腔注射重组 Re-Lcn2，小鼠视网膜中 IRBP 和外周蛋白表达水平降低（图 5C）。对 Re-Lcn2 处理的 661W 细胞进行非靶向代谢组和转录组测序联合分析，结果显示 Re-Lcn2 主要抑制了细胞中糖酵解过程（图 5F）。代谢组检测结果显示 Re-Lcn2 处理显著降低了细胞和培养基中乳酸水平（图 5E, I）。

收集高糖暴露的 Lcn2 敲降的 BV2 细胞培养基，并与 661W 细胞孵育，结果显示 sh-Lcn2 可以抵抗高糖对 661W 细胞的损伤（图 6B），细胞的乳酸增加（图 6D）。Kdm6a 过表达的 BV2 细胞培养基与 661W 细胞孵育，可以降低 661W 细胞的存活率；而 sh-Lcn2 + OE-Kdm6a 的 BV2 细胞培养基与 661W 细胞孵育，可以恢复 661W 细胞的活力（图 6C），增加细胞的乳酸产生（图 6G）。

以上表明，来自小胶质细胞/巨噬细胞的 Lcn2 的增加损害了感光细胞的糖酵解进程。

5、小胶质细胞/巨噬细胞中的 Kdm6a 缺乏维持光感受器中正常的糖酵解过程

条件敲除小鼠 IRBP 和外周蛋白表达升高（图 7A-B）。si-Kdm6a BV2 细胞培养基与 661W 细胞孵育（图 7C），661W 细胞中 IRBP 蛋白表达水平显著上升（图 7D），661W 细胞的存活率升高（图 7E），细胞上清中乳酸含量增加（图 7F）。Kdm6a 敲除减弱了 Re-Lcn2 对 661W 细胞中乳酸排泄的抑制作用（图 7F）。暴露于 Re-Lcn2 的 BV2 细胞中 Kdm6a 敲降后，661W 细胞中糖酵解的主要酶活性的变化升高（图 7I）。

以上结果表明，小胶质细胞/巨噬细胞中Kdm6a的缺失维持了光感受器的正常糖酵解，并减少了糖尿病视网膜病变的损害。

6、Kdm6a 和 Lcn2 的减少直接改善糖尿病视网膜病变

接下来在体内研究 Kdm6a 和 Lcn2 的作用。将 siRNA 注射到小鼠玻璃体腔中以干扰 Kdm6a 和 Lcn2 表达，结果显示 IRBP 和周边蛋白表达升高（图 8 C-D），表明体内干扰 Kdm6a 和 Lcn2 可以改善糖尿病视网膜病变。

本研究用条件敲除小鼠建立了糖尿病动物模型，以研究 Kdm6a 缺乏的影响。

结果显示，糖尿病小鼠视网膜中 Kdm6a 的表达增加。小胶质细胞/巨噬细胞中的 Kdm6a 以去甲基化酶活性依赖的方式调节 Lcn2 的表达，并通过 Lcn2 抑制光感受器细胞中的糖酵解进程。这些结果表明，小胶质细胞和巨噬细胞中的 Kdm6a 通过促进 Lcn2 表达和损害光感受者细胞中的糖解进程而加重糖尿病视网膜病变。

欧易生物在本研究中承担了转录组测序及分析工作。

原文链接：

10.1016/j.metabol.2022.155293

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排版人：小久

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