CTM:重庆医科大学附属第一医院研究团队发现LINC01606保护肠癌细胞免于铁死亡及促进干性的机制

铁死亡（ferroptosis）是一类以依赖铁代谢产生致死性脂质活性氧为特征的细胞调节性死亡，其与肿瘤的发生发展密切相关。铁死亡在肿瘤中起着负调控的作用，扮演者抗肿瘤的角色，主要通过强化肿瘤免疫、诱导肿瘤干细胞的死亡和缓解耐药等发挥作用。长链非编码RNA LINC01606在肿瘤的发生发展中起着重要的作用，其是否通过调控细胞铁死亡的方式介导肿瘤发生发展的作用仍不清楚。

近日，重庆医科大学附属第一医院胃肠外科傅仲学教授团队在Clinical and Translational Medicine（IF:11.492, 中科院一区）在线发表了题为“Long noncoding RNA LINC01606 protects colon cancer cells from ferroptotic cell death and promotes stemness by SCD1-Wnt/β-catenin-TFE3 feedback loop signalling”的研究论文。

使用铁死亡诱导剂Erastin和RSL3处理结肠癌细胞后细胞活性明显的降低，并且可被铁死亡抑制剂Fer-1抑制。在形态学上，透射电镜观察细胞出现典型的铁死亡形态学变化：线粒体嵴的减少，线体膜的破裂，而细胞核基本正常。当LINC01606基因敲低时，明显增加铁死亡诱导剂Erastin和RSL3的细胞毒性作用，在形态学上明显加重细胞的损伤程度出现线粒体完全破裂，结构模糊不清；当LINC01606基因过表达时，明显降低铁死亡诱导剂Erastin和RSL3的细胞毒性作用。在形态学上明显缓解细胞的损伤程度单纯的出现线粒体嵴的减少、部分外膜的破裂，但线粒体结构完整（图一）。

图一 LINC01606对结肠癌细胞铁死亡细胞活性及形态学的影响

细胞内铁在诱导铁死亡的过程中起着重要的作用，LINC01606抑制细胞内铁的水平；脂质ROS在诱发铁死亡的过程中起着核心作用，LINC01606抑制细胞脂质ROS的水平；线粒体超氧化物可产生超氧阴离子自由基等，能够氧化脂质对脂质ROS产生起着重要的作用，并且还能引起线粒体的损伤，LINC01606抑制细胞内线粒体超氧化物的水平；线粒体膜电位是线粒体功能的体现，在维持细胞正常功能中起着先决条件的作用，当线粒体膜电位下降是细胞发生死亡的早期标志性事件，LINC01606增加细胞内线粒体膜电位的水平（图二）。说明LINC01606通过降低细胞内铁、脂质ROS以及线粒体超氧化物，增加线粒体膜电位来保护细胞减少Erastin和RSL3诱导的铁死亡。

图二 LINC01606对结肠癌细胞细胞内铁、脂质活性氧、线粒体超氧化物、线粒体膜电位的影响

球细胞的形成是干细胞的主要特征之一，LINC01606的表达水平在球细胞中增高；CD133和CD44是结直肠癌干细胞主要标志之一，LINC01606的表达水平在CD133⁺CD44⁺细胞高于CD133^-CD44^-细胞。LINC01606能够促进结肠癌细胞体外的成球能力、体内成瘤能力，增加干性标志物的表达、CD133⁺CD44⁺细胞的比例（图三），说明LINC01606能促进结肠癌细胞的干性。

图三 LINC01606促进结肠癌细胞的干性

CD44⁺CD133⁺细胞中细胞内铁、脂质活性氧、线粒体超氧化物低于CD44^-CD133^-细胞，而线粒体膜电位高于CD44^-CD133^-细胞，提示结肠癌干细胞对铁死亡的耐受性高于普通肿瘤细胞（图四）。

图四 CD44⁺CD133⁺/CD44^-CD133^-细胞内铁、脂质活性氧、线粒体超氧化物、线粒体膜电位的变化

首先在结肠癌细胞中发现LINC01606能够活化Wnt/β-catenin信号，然后通过Topflash/Fopflash实验验证LINC01606能够增加β-catenin介导的LEF/TCF转录活性。最后，发现Wnt抑制剂C59能够抑制Wnt信号分子的表达，同时能够抑制LINC01606和SCD1的表达；而激动剂BML-284能够激活Wnt信号分子的表达及同时促进LINC01606和SCD1的表达。说明Wnt/β-catenin信号的活化可以促进LINC01606表达，LINC01606与Wnt/β-catenin信号形成正反馈调控（图五）。

图五 LINC01606激活Wnt信号

为了验证LINC01606是否通过SCD1-Wnt/β-catenin信号轴调控细胞铁死亡，我们分别使用Wnt抑制剂C59和激动剂BML-284以及联合过表达LINC01606处理结肠癌细胞，检测细胞内铁、线粒体超氧化物、脂质ROS及线粒体膜电位的变化，发现Wnt抑制剂C59能够增加细胞内总铁和Fe²⁺、线粒体超氧化物和脂质ROS，降低线粒体膜电位，并且过表达LINC01606能够削弱Wnt抑制剂C59的上述作用；Wnt激动剂BML-284能够降低细胞内总铁和Fe²⁺、线粒体超氧化物和脂质ROS，增加线粒体膜电位。这一结果一方面说明Wnt/β-catenin信号通路也参与到细胞铁死亡的调控，活化该信号通路可以抑制铁死亡；另一方面说明LINC01606保护细胞抑制铁死亡是通过Wnt/β-catenin信号通路实现（图六）。

图六 LINC01606-Wnt/β-catenin信号轴抑制结肠癌细胞铁死亡

通过对结肠癌细胞40种中长链脂肪酸浓度的变化分析，发现干扰LINC01606后有9种脂肪酸浓度变化大于1μg/107，这9种脂肪酸中有4种SFAs升高：棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、花生酸（C20:0）和二十二烷酸（C22:0），有3种PUFAs升高：亚油酸（C18:2n6）、花生四烯酸（C20:4n6）、二十二碳五烯酸（C22:5n3），2种MUFAs降低：棕榈油酸（C16:1n7）及油酸（C18:1n9）。SCD1主要作用是将棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）去饱和后转化为棕榈油酸（C16:1n7）及油酸（C18:1n9），我们通过进一步的分析发现这4种脂肪酸在干扰LINC01606后浓度程度变化最大，且干扰LINC01606后能增加棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）的浓度，降低棕榈油酸（C16:1n7）及油酸（C18:1n9）的浓度，并且C16:0/C16:1n7及C18:0/C18:1n9的比例显著升高（图七）。

图七 LINC01606对铁死亡中脂肪酸代谢的影响

综上所述，一方面LINC01606激活Wnt信号，并与其Wnt信号形成正反馈，导致不断放大Wnt/β-catenin信号使肿瘤细胞具有不断的自我更新能力；另一方面大量的合成MUFAs不仅为肿瘤细胞的生长特别是细胞膜的合成提供原料也为细胞代谢过程提供能量，并且还抑制脂质的氧化而抑制铁死亡，从而启动肿瘤的进展及介导耐药的发生。最终，通过上述机制LINC01606促进肿瘤发生及发展（图八）。

图八 LINC01606促进结肠癌发生发展的机制图

本研究中使用的LINC01606干扰和过表达慢病毒来自吉凯基因，助力高效率的基因干扰和过表达（图九）。

图九 LINC01606在结肠癌细胞中干扰和过表达的效率

重庆医科大学附属第一医院胃肠外科傅仲学教授为论文通讯作者，罗雅军博士为论文的第一作者，黄思棋为论文的共同第一作者。