空前但不绝“鲎”——重组C因子（rFc）新一代内毒素检测方法

在这个地球上存在一种生物，它使用蓝色的鲜血挽救了我们很多人的性命，它是我们安全用药的卫士，然而我们大多数人却不知道它名字甚至不知道它的存在！

鲎（图片来源：Wikipedia）

  鲎（Limulidae）读音[hòu] 就是我们今天的主角，它是一种古老的物种，从地质历史时期古生代的泥盆纪就一直存活至今。这位来自大海的远古遗民一旦雌雄结合后便形影不离，海枯石烂，相依为命。有“海底鸳鸯”的美称，一旦出现生命危险，雌的先被抓住，雄的会生死不离，义无反顾地殉情，但是如果雄的先被抓住，雌鲎丢下伴侣逃之夭夭……

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看到这里，大家不要误解雌鲎，这是因为雄鲎虽然不愿意自己单独逃命，但是却愿意放“妻子”一条生路。雄鲎为爱殉情，是悲壮的生命与爱情专一的绝唱！而雌鲎的逃脱也是一种智慧的抉择和生存的需要，毕竟它寄托着丈夫的希望，孕育着丈夫的生命延续。

鲎，趴在海边的沙滩上安详的晒了约四亿年的太阳，终于在最近几十年找到了用武之地。但这也是它们悲惨命运的开始……

Drs.Frederick B. Bang and Jack Levin

自1968年美国科学家Levin和Bang发现并建立鲎实验方法以来，细菌内毒素鲎试剂检查法在注射药品质量控制领域发挥了巨大的作用，避免了静脉注射后的发热，让静脉疗法得以迅速推广。内毒素检测也成为保证药品安全的重要检查项目之一。

在中国我们也应该感谢一下这位吴老先生

吴伟洪先生中国鲎试剂事业的开拓者之一及1983出版的鲎与鲎试验法论文汇编

吴伟洪先生在鲎试剂领域是个传奇人物，开创了从白丁到国内鲎试剂（东方鲎TAL）领域的先驱者传奇故事。上世纪七十年代吴伟洪带领三五个人的团队就做出了国内第一支鲎试剂，填补了鲎试剂在国内的空白，开创了鲎试剂在国内检测历史，为鲎试剂在国内的推广和普及做出来巨大的贡献。

鲎试剂是从海洋动物鲎提取的血细胞溶解物,是检测革兰氏阴性细菌内毒素的一种敏感试剂。鲎试剂会和内毒素起反应形成凝胶，内毒素通俗一点说就是细菌死亡的细胞壁分泌物，如果含有内毒素的药品，注射到人体里就会发热，严重的就会死亡。因此只要是要注射或者输入或者植入人体的药品，器械都需要做内毒素检测。鲎试验(Limulustest)可作为革兰氏阴性细菌败血症、脑膜炎和尿路感染等的一种快速、敏感的诊断方法,并可应用于注射药品及生物制品的热原质检测,卫生学上可用来检查各种水质和食品污染的程度。

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不同于其他物种的血液中含有铁离子，血液是红色的。鲎血液中含有铜离子，携氧后变成蓝色，它也是地球上为数不多的拥有蓝色血液的动物。在最近的几十年里，它们已经变成了人类的救命药。鲎的血液可以制成专用于细菌内毒素检测的试剂TAL或LAL，目前这已发展为庞大的产业，由美国食品药品监督管理局（FDA）、中国国家药品监督管理局（NMPA）等各国食药监督管理机构授权生产的每种药物，都必须经过TAL或LAL测试，用于检测革兰氏阴性细菌细胞壁的成分脂多糖（内毒素）的含量是否超标，尽可能避免静脉注射或手术引起的发热反应。

图片来源：http://www.houshiji.com/Product/detail/classid/91/id/71.html

 鲎试验检测法的灵敏度超乎你的想象，它能检测小于万亿分之一克（0.000000000001 Grams）的热原，万亿分之一没有什么概念，这么说吧，它相当于等于320世纪中的1秒，奥林匹克标准尺寸游泳池中的1粒砂糖。

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这样的超级灵敏度让TAL和LAL可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；可以确保所有进入静脉或体内的药物、器械是安全可靠的。内毒素的浓度和反应的启动时间程负相关，浓度越高，反应启动时间越短。

因此鲎如果一旦消失，对现代生物医学将会有巨大的冲击。很不幸的是，现有的鲎的生存情况并不好，特别是生活在亚洲地区的鲎：海堤的建设，导致其产卵的海滩面积逐步缩减；海洋的污染、过度捕捞都成了鲎数量不断减少的原因，我国广东 、广西 、福建等省已将其列入二级保护动物。

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现在，TAL和LAL已经成为一个价值数百万美元的行业。据报道，1夸脱（1夸脱约为0.946升）鲎血液价值高达17，000美元，而一套试剂的价格高达1000美元。昂贵的试剂价格以及濒危的数量都成为了科学家寻找替代TAL和LAL的动力。

虽然鲎试剂在内毒素检测中扮演着重要的角色，但是这种基于鲎采血的生产方式，现阶段正面临着严峻的挑战。因为可用于采血的鲎越来越少了，就在这个时候，一个伟大人物出现了。

丁玲，新加坡国立大学生物学教授Jeak L. Ding National University of Singapore |NUS · Department of Biological Sciences

笔者找遍网络终于找到了这张丁玲教授的照片，让我们认识一下并记住这个无论是鲎还是我们人类都应该感谢的科学家。

从上个世纪80年代开始，丁玲教授通过十余年的不懈努力，基于转基因技术终于开发出了LAL的替代品，第一个非鲎血指示剂测试盒在2003年问世。

至此，我们的故事才刚刚开始：

由于丁玲教授的努力，我们从传统的取鲎血，开发试剂，用于细菌内毒素的检测方法，发展到利用现代基因工程技术生产无动物源的重组C因子（rFc）内毒素检测试剂，让已经晒了四亿年的鲎又可以稍稍松一口气，继续悠闲地的在海滩上晒太阳了。

但是最初制药公司对此也没有多大兴趣，仍然继续热衷使用传统的鲎血法进行检测，其原因主要有以下几点：

1、在最初开始的时候，重组法的稳定性不如传统方法。

2、重组法试剂较传统方法更贵。

3、这项技术是基于丁玲的技术专利，并且只允许了一家瑞士化学公司LONZA供应这种合成试剂，制药企业不想被一家公司牵着鼻子走。

4、LONZA一直在和另外一家公司为rFc方法的专利使用权打官司。

随着时间的推移，LONZA也意识到一家独大未必是好事，2013年，LONZA和Hyglos达成和解，LONZA不再是唯一的供应商。Hyglos成为第二家生产合成因子C的公司。在监管方面，欧洲药典于2016年增加了因子C作为公认的细菌-毒素测试，FDA及美国药典已接受重组C因子法（rFC）作为一种替代方法，日本药典基于rFC方法与传统鲎试剂法的研究，承认该方法无差别。这也为鲎试剂的变革铺平了道路。现在，越来越多的制药企业加入合成毒素指示剂的制造中。

在欧洲、美国、日本等发达列强陆续认可rFc检测方法后，中国食品药品检定研究院也与时俱进紧追科技前沿，于2015年在一部分省市食药监局开展rFC方法可行性论证，笔者也有幸受邀参与部分实验。

简单总结一下rFC内毒素荧光检测方法优点：

• 内毒素特异性，重组技术消除了鲎试剂中β-1,3-葡聚糖对检测结果的干扰，导致潜在假阳性的产生

• 避免鲎的个体化差异所导致的鲎提取试剂的批次不稳定，最终导致结果批间差异较大。rFc利用基因工程技术，可以获得更小的批间差异。

• 可预测的，可靠的检测性能

• 可持续资源，供应稳定，没有动物源的限制

• 终点荧光法，可比其他定量鲎试剂方法

• 具有广泛的灵敏度范围（0.0.005-50.0EU/ml）

• 药典收纳

我们先来介绍一位巨头：LONZA - A Global Leader in Life Sciences

LONZA（龙沙） 瑞士的制药化工巨头，龙沙集团是一家以生命科学为主导，在生物化学、精细化工、功能化学等行业均处于领先地位的全球性跨国公司，具有一百多年历史，总部位于瑞士巴塞尔。2018年LONZA龙沙实现全年销售额55亿瑞士法郎。

PyroGene™ rFC试剂盒是Lonza公司生产的重组法荧光检测试剂盒，是传统内毒素的检测测试的演变。通过内毒素结合并激活的重组C 因子能够切割底物获得游离的荧光基团,荧光基团的释放与内毒素的浓度呈正比,从而使得内毒素被定量检测。

更多关于PyroGene rFC的信息可以参考试剂盒说明书

为了全面推广PyroGene rFC方法，LONZA公司花重金从BioTek Instruments定制了PyroWaveXM荧光内毒素检测仪，该仪器具有卓越的温控能力， rFC特异性专属光学元件，完美的支持rFC检测，提供稳定可靠的检测结果。

说起Hyglos这家公司，可能了解的人不多。但是他的母公司几乎就是行业内无人不知无人不晓了，大名鼎鼎的法国公司生物梅里埃（bioMérieux）。

生物梅里埃是全球诊断领域的十大生产商之一，全球细菌学市场第一，全球第二大感染性疾病诊断厂家。这些都不是我们今天关注的重点，我们在这里只关注鲎试剂替代产品：重组C因子内毒素检测试剂盒。

梅里埃也为自己的rFC产品定制一款专用检测仪，比较众多厂家后也选择BioTek Instruments，为了更好匹配自己试剂的特点，梅里埃定制SynergyHTX多功能内毒素检测仪。

该白皮书可以留言或加入文末的群向作者索取

SynergyHTX多功能内毒素检测仪，该仪器具有卓越的温控能力， rFC特异性专属光学元件，完美的支持rFC检测，提供稳定可靠的检测结果。该仪器同时也可以兼容传统动态浊度法细菌内毒素检测。 

生物梅里埃ENDONEXT™内毒素检测试剂盒系列，其使用灵活，检测快速，并可以应对复杂样品，可应用于原辅料、过程控制和终产品检测。

生物梅里埃EXDONEXT可为每一步生产过程提供内毒素检测方案

是时候让这家公司冒个泡了，BioTek Intruments，微孔板相关设备的制造商领导者之一，其生产的微孔板检测仪ELx808IU，Epoch2，SynergyHTX，SynergyH1已经成为内毒素试剂生产厂家的首选，行业标准。

2019年年初，2020版药典细菌内毒素检测征求意见稿发布，在内毒素检测行业内引起激烈讨论，作者多年来一直混迹于这个行业，总觉得应该说点什么,但是又不晓得说啥子，就对这个征求意见稿解读一下，希望可以抛砖引玉，有越来越多的朋友一起讨论。

从2015年起，作者就在国家相关机构的指导下，协助药检专家进行rFC荧光内毒素检测法的可行性论证。下面就讲讲作者自己对rFC检测方法的理解，供大家参考。

使用rFC荧光法检测细菌内毒素的首要条件是检测过程应避免细菌内毒素污染。

推荐仪器：

PyroWaveXM

SynergyHTX

试剂：

所有试剂，包括荧光溶质和检测用缓冲液，均必须无内毒素。必要时，根据测试盒生产商的指示要求溶解试剂。试剂应根据生产商要求冷藏或冷冻条件下存贮。

BET用水（细菌内毒素检测用水）：

注射用水R或采用其它方法生产的水，在试剂检测限水平不会与试剂发生反应。

标准内毒素贮备液制备：

标准内毒素贮备液采用经过国际标准如内毒素标准BRP标定的内毒素标准品制备，内毒素单位为国际单位（IU），国际标准的IU等同性由WHO规定。遵照包装说明书和标签上的要求制备和存贮标准内毒素贮备液。

标准内毒素溶液制备：

剧烈混合标准内毒素贮备液，使用BET用水制备适当级别稀释液，溶液应尽快使用以避免活性因吸收而降低。

供试液制备：

用BET用水溶解或稀释原料药或制剂制备供试液。有些原料药和制剂可能需要溶解或解释在其它水性溶液中。必要时，调节供试液pH值（或稀释）使得试剂与供试液混合物的pH值在测试盒生产商所指定的pH范围内，通常为6.0-8.0。可根据测试盒生产商的建议使用酸碱或适当的缓冲液调整pH。酸碱可采用浓缩物或固体经BET用水在没有可检出内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证无可检出内毒素和干扰因子。

最大有效稀释度确定：

按照试剂盒或药典描述的方法进行确定。

荧光定量检测：

本实验是基于内毒素浓度和试剂混合物在孵育结束后的荧光之间的定量关系，表示为ΔRFU。

ΔRFU= RFUtend-point- RFUt0

RFUt0：孵育开始时试剂混合物荧光，对于所有的待测样品来讲，RFUt0应该是非常接近的，表明所有待测样品本底信号是均匀一致的，没有其他因素的干扰。

RFUtend-point：孵育结束时试剂混合物荧光

在检测盒生产商所建议的孵育温度进行检测（通常为37 ±0.5°C）。

预检测：

预检测是为了确保荧光技术有效性。此检测是为了证明满足标准典线的标准，并且供试液对检测无干扰。

标准曲线标准：

仪器灵敏度必须根据每批rFC或标准内毒素进行调整，其设置必须符合测试盒生产商的建议。使用标准内毒素溶液，在试剂盒生产商指定的浓度范围内制备至少3个内毒素浓度溶液，制作标准曲线。如果所需范围超出生产商所指定浓度范围的2个以10为底的浓度对数，则必须包括更多标准以覆盖范围内每个浓度对数增加值。按生产商建议（体积比、培养时长、温度、pH等），每个标准内毒素溶液至少配制3份重复检测。

在所制备的内毒素浓度范围内，相关系数绝对值|r|必须大于等于0.980。

干扰因子：

由于rFC试剂盒没有因子G，因此无法激活假阳性β-葡聚糖。在将本方法与其它细菌内毒素定量方法进行比较时必须考虑此情况。

选择等于或接近于内毒素标准曲线中间值的内毒素浓度。按下表要求配制溶液A、B、C和D。按检测合生产商要求每个溶液至少检测2次（供试液和测试试剂盒混合物体积，供试液与测试试剂盒混合物的体积比，培养时间等）。

如果满足以下要求，则认为检验有效

• 溶液C制作的标准曲线的相关系数r绝对值大于等于0.980

• 溶液D所得结果不得超过所用试剂混合物描述所要求的空白限值，或低于所用rFC的内毒限检测限。

• 从添加了内毒素的溶液中（溶液B，上表）扣除溶液中平均内毒素浓度（如有）（溶液A，上表）计算平均回收率。

• 如果在检测条件下，供试液中添加内毒素后检出浓度扣除未添加前溶液中检出的内毒素后，为已知添加浓度的50-200%，则认为供试液没有干扰因子。

如果内毒素回收率超出指定范围，则认为供试液含有干扰因子。使用不超过MVD的更大稀释倍数重复检测。另外，供试液或稀释后供试液（未超过MVD）的干扰有可能通过执行适当的经验证的处理方法消除，例如，过滤、中和、渗析、热处理或内毒素专用绑定步骤（在没有干扰基底时，检测之前从供试液中富集内毒素）。为证明所选处理方法可有效消除干扰而不损失内毒素，应使用待检样品添加标准内毒素和进行所选处理的样品重复干扰因子测试。 

检测程序

检测程序和预检测步骤基本是一样的，把需要的检测样品作为供试品即可。Lonza和Hyglos都有特别编写的程序，完成供试品在板上的分布后，直接运行即可。仪器会自动完成检测并给出检测分析结果。

RFUt0、RFUtend-point检测结果示意图

所有供试品及标准品的RFUt0的初始值都在同一水平上。

以logΔRFU和log标准品的浓度值做线性拟合，得到下图标准曲线

标准曲线的回归系数，r²应大于0.9604，即r绝对值大于0.980，才能判定标准曲线有效。

系统会自动判断是否符合预设的条件，给出有效或无效的结论。

如果空白对照（BLK）的平均内毒素浓度低于标准品的最低内毒素限值，则认为符合要求。

至此，rFC检测基本完成，每个公司可以根据自己公司的要求，编辑自己特殊要求的检测报告，审计追踪，电子签名，QC趋势图等等，就不再一一赘述。

传统鲎试剂在内毒素检测中扮演着重要的角色，但是随时鲎的不断减少，越来越多的国家和地方把鲎列为野生保护动物，基于采鲎血的生产方式，现阶段正面临着严峻的挑战。rFC和其他无动物源的检测方法的重要性越来越凸显出来了。

行业资深人士，厦门鲎试剂生物科技股份有限公司吴尚毅总经理告诉作者，rFC作为一种新的方法，目前还没有完全代替传统方法的可能性，还有很长的路要走，很多地方需要改进。目前他公司也已经开发出基于东方鲎的无需动物源的rFC内毒素检测方法，检测灵敏度和稳定性和国外产品相比更具优势。

在巨大的市场吸引下，越来越多的优秀人才和公司加入rFC的研究中，我们有理由相信在不久的将来，rFC一定会替代传统使用鲎血的细菌内毒素检测方法，做的真正的空前但不绝“鲎”。

如果您想了解更多关于细菌内毒素检测方法，有兴趣的朋友可以自己查看各国药典通则。

欢迎有兴趣的各位老师、朋友，扫码加入 Endotoxin内毒素检测群给予指导和讨论。

参考文献：

1、  互联网资料

2、  裴宇盛 蔡彤 陈晨 高华 魏霞 刘洋 王婷婷 祝清芬 陆益红 朴晋华 刘琦 张蕻 李松梅.重组C因子法检测细菌内毒素的方法适用性研究.中国药业

3、  王莉, 高华, 蔡彤, 张国来, & 季晖. (2007). 鲎试剂的研究及应用进展. 药物分析杂志(6), 938-942.

4、  欧洲药典在线 http://pharmeuropa.edqm.eu/TextsForComment/

5、  中国药典，细菌内毒素检测通则

6、BioTek 产品在细菌内毒素检查法中的应用

7、2007 细菌内毒素检测技术与应用 湛江安度斯