IF18！以蛋白质组为突破口，国内上海交大等合作团队揭示自噬参与的促癌机制

口腔鳞状细胞癌 (OSCC) 是最常见的口腔恶性肿瘤，转移是导致 OSCC 预后不良的原因。自噬被认为通过缓解各种细胞压力来促进 OSCC 的发展。然而，自噬在 OSCC 细胞增殖和转移中的机制尚不清楚。

近日，上海交通大学、浙江大学和陆军军医大学的研究团队合作在Signal Transduction and Targeted Therapy（中科院JCR一区，IF：18.187 ）上发表了题为“NUPR1 promotes the proliferation and metastasis of oral squamous cell carcinoma cells by activating TFE3-dependent autophagy”的研究论文。研究者通过对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本的蛋白质组进行检测，发现了一个在淋巴结转移组中显著上调的蛋白——NUPR1，并通过实验明确NUPR1-TFE3轴通过自噬途径促进 OSCC 细胞增殖和体内外转移的机制。本研究可能为 OSCC 的治疗提供潜在的治疗靶点。

作者对10个有淋巴结转移（LNM）和10个无淋巴结转移的口腔鳞状上皮细胞癌组织FFPE样本进行了蛋白质组学检测，共定量了3021个蛋白。有淋巴结转移比无淋巴结转移分析得到208个上调蛋白和165个下调蛋白。其中NUPR1蛋白在有淋巴结转移组中的表达显著高于无淋巴结转移组，是上调倍数前五的蛋白。

研究者使用免疫组化染色（IHC）进行了NUPR1的组织芯片（TMA）实验（OSCC组织88个，正常口腔黏膜组织20个）。结果显示，NUPR1在OSCC组织中显著高表达。临床相关性分析显示，高表达NUPR1与OSCC TNM分期和淋巴结转移正相关。KM分析表明，高表达NUPR1的患者有更低的总生存率，即高表达NUPR1意味着不良的预后。

为了明确NUPR1在OSCC进展中的作用，作者在高表达NUPR1的Cal27和HN6 癌细胞系中对NUPR1进行敲低（NUPR1 KD）。集落形成实验显示，NUPR1 KD显著降低了癌细胞的集落形成效率。此外，伤口愈合和Transwell检测显示，NUPR1 KD 的OSCC细胞迁移和侵袭能力明显受到抑制。总体而言，NUPR1 敲低有效地抑制了OSCC的进展。

为了阐明NUPR1在OSCC进展中的潜在机制，研究者通过TMT定量蛋白质组学检测了NUPR1敲低的Cal27细胞和对照细胞之间的蛋白谱变化（3vs.3）。与对照组相比，NUPR1敲低的OSCC组中27个蛋白显著上调，28个蛋白显著下调。KEGG富集显示，NUPR1敲低组的自噬通路显著富集。该结果表明，自噬可能在NUPR1介导的OSCC进展中发挥重要作用。

接下来，研究者进一步探索了NUPR1敲低是否影响OSCC细胞的自噬流（autophagic flux）。MAP1LC3B-I是一个公认的自噬标记，通常驻留在细胞质，但在诱导自噬时，它会被脂化并嵌入自噬体膜(形成MAP1LC3B-II 异构体)。免疫印迹分析显示NUPR1敲低增加MAP1LC3B-II的蛋白表达水平。此外，在Cal27和HN6细胞中也检测到SQSTM1的明显升高。自噬涉及多个步骤，自噬小体的积累可能是由于自噬活性上调或自噬小体周转减少所致。NUPR1敲低导致MAP1LC3B-II和SQSTM1的表达增加，这似乎意味着NUPR1 敲低损害了OSCC细胞的自噬流。氯喹(CQ)抑制溶酶体活性，干扰自噬体和溶酶体之间的融合，抑制自噬。然而，NUPR1敲低诱导的MAP1LC3B-II表达的增加不受CQ共处理的影响。这些结果表明，NUPR1敲低抑制了OSCC细胞的自噬流。

由于自噬是一个动态的再循环系统，具有多步骤的过程，研究者进一步研究了NUPR1敲低在早期或晚期诱导的自噬抑制作用。最终结果表明，NUPR1 敲低并不能影响OSCC细胞中自噬小体的形成或成熟。

自噬小体与溶酶体的融合是自噬降解的一个基本过程。研究者通过实验发现，在Cal27和HN6细胞中，自噬体标记物GFP-LC3和溶酶体标记物LAMP2之间的共定位比例不受NUPR1敲低的影响。

为了研究NUPR1敲低是否抑制溶酶体功能，研究者检测了位于溶酶体膜表面的溶酶体标记物LAMP1和LAMP2的表达水平。结果表明，NUPR1敲低抑制了Cal27和HN6细胞中LAMP1的表达，但没有抑制LAMP2的表达。在NUPR1敲低的OSCC细胞中，溶酶体蛋白水解活性明显被抑制。因此，NUPR1敲低对自噬流的损害可能是通过抑制OSCC细胞中的溶酶体功能来介导的。

为了阐明NUPR1介导的自噬-溶酶体加工的潜在机制，研究者分析了NUPR1敲低的Cal27细胞与对照细胞之间的差异蛋白。NUPR1敲低OSCC细胞中，TFE3显著下调。研究者同时用PCR证实了自噬流中涉及的“TFE3应答基因”的表达变化，提示NUPR1在自噬溶酶体事件中发挥了关键作用，并可能与TFE3有关。

最近，NUPR1被报道为调控基因转录的重要转录因子。因此，研究者采用荧光素酶报告基因实验来检测NUPR1和TFE3之间的关系。结果表明，在自噬激动剂雷帕霉素(0.1µM)处理24h的OSCC细胞中，TFE3启动子活性明显增加，但与对照组相比，在NUPR1敲低的OSCC细胞中明显被抑制。综上所述，在OSCC进展过程中，NUPR1通过增加TFE3启动子活性和激活TFE3转录来维持自噬流。此外，研究者在OSCC组织中检测了TFE3，发现NUPR1与TFE3的表达呈正相关。过表达TFE3可以显著挽救NUPR1敲低对Cal27和HN6细胞溶酶体功能的损伤。此外，在NUPR1缺失的OSCC细胞中，TFE3过表达也显著降低了MAP1LC3B-II和SQSTM1的积累。

最后，研究者对TFE3进行过表达，观察NUPR1敲低OSCC细胞进展能力的变化。结果表明，TFE3过表达部分逆转了NUPR1敲低介导的OSCC细胞迁移和侵袭的抑制作用。

此外，研究者还发现NUPR1敲低导致接种于裸鼠皮下的Cal27细胞形成的肿瘤的体积和重量明显减少。NUPR1敲低也抑制了转移性结节的形成和生长。同时，NUPR1敲低有效地抑制了异种移植瘤模型中TFE3和“TFE3应答基因”的表达。在对转移性结节的评估中也得到了同样的结果。总之，这些发现表明，NUPR1敲低对OSCC进展的抑制依赖于TFE3活性的抑制。

研究者对有淋巴结转移和无淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌 (OSCC)组织FFPE样本进行了基于质谱的蛋白质组学检测。NUPR1被确定为在有淋巴结转移的患者中显著高表达的关键蛋白，并与OSCC转移和不良预后呈正相关。NUPR1敲低能显著OSCC细胞系的增殖和转移。后续机制实验进一步确定NUPR1敲低诱导癌细胞自噬流损伤，且是通过影响溶酶体功能障碍而非其他关键的自噬步骤。最后，研究者进一步确认，在OSCC进展过程中，NUPR1通过增加TFE3启动子活性和激活TFE3转录来维持自噬流。因此，本研究拓宽了关于NUPR1-TFE3依赖的自噬在OSCC进展中的潜在治疗靶点的新见解。

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