项目文章 | LC-MS/GC-MS双平台代谢组学助力中药处方预防延缓糖尿病视网膜病变机制研究

2022年02月，中国中医科学院广安门医院李敏教授课题组在Biomedicine & Pharmacotherapy发表的题为 “Yiqi Tongluo Fang could preventive and delayed development and formation of diabetic retinopathy through antioxidant and anti-inflammatory effects ”的研究成果，发现了益气通络方可有效地防治糖尿病并发症形成与发展，探究了益气通络方防治糖尿病视网膜病变的作用机制，益气通络方可改善糖尿病大鼠视网膜组织病理损害；提高视网膜紧密连接蛋白，保护血-视网膜屏障；抑制p38MAPK相关通路及IncRNA MALAT1水平；降低全身及局部视网膜的炎症及氧化应激水平。为益气通络方防治糖尿病视网膜病变提供了实验依据。LC-MS+GC-MS双平台代谢组学主要用于全面的中药成分分析。

糖尿病视网膜病变（DR）的患病率逐年增加。DR的发病机制复杂，主要包括炎症和氧化应激。而中药处方益气通络方可有效防治糖尿病视网膜病变的形成与发展，但其作用机制尚不清楚。本篇研究通过对益气通络方防治糖尿病大鼠视网膜病变相关机制深入研究，探寻益气通络方防治糖尿病视网膜病变的内在途径和机制。

1. 实验分组/研究材料

实验分组

（1）正常对照组：25只

（2）糖尿病对照组：25只

（3）糖尿病+胰岛素+羟苯磺酸钙（CaD）组：25只

（4）糖尿病+胰岛素+益气通络方（YQTLF）组：25只

研究材料

SD雄性大鼠；链脲佐菌素；羟苯磺酸钙；益气通络方；复方托吡卡胺滴眼液；盐酸奥布卡因滴眼液；荧光素钠注射液；ELISA试剂盒；BCA分析试剂盒；多聚甲醛；蒸馏水；乙醇等

2.技术路线

2.1 LC-MS+GC-MS：测定YQTLF代谢物

2.2 生化检验：自动生化分析仪测量血清相关指标浓度；ELISA试剂盒测定血清氧化应激和炎症参数

2.3胰蛋白酶消化试验：计数无细胞毛细血管、内皮细胞和周细胞的数量、内皮细胞与周细胞的比率

2.4 Tunnel法：显微镜下观察凋亡细胞

2.5 Western blot：BCA分析试剂盒对大鼠视网膜蛋白质的含量量化

2.6 RT-PCR：大鼠视网膜中提取总RNA，逆转录后扩增SYBR PCR混合物，采用2-△△ct法相对定量分析

UPLC-MS在YQTLF中共检测到15105个物质峰，其中鉴定出6058个代谢物，包括来自负离子模型的2365个代谢物和来自正离子模型的3693个代谢物（图1）。

YQTLF对视网膜组织学的影响通过以下方法进行评估：包括FP、FFA、H&E染色、视网膜胰蛋白酶消化铺片试验和TUNEL染色。

H&E染色测定每层的厚度，对照组大鼠的视网膜组织良好。但糖尿病大鼠各层细胞排列松散、不规则且结构紊乱。CaD和YQTLF处理改善了每层受损细胞（图4A）。与对照组相比，糖尿病大鼠的ONL、OPL、INL、IPL和GGL以及整个视网膜的ONL、OPL、INL、IPL和GGL显著降低。与糖尿病大鼠相比，CaD和YQTLF增加了视网膜的厚度。结果表明，与CaD治疗相比，YQTLF治疗改善了视网膜组织厚度和整个视网膜（图4B）。

视网膜胰蛋白酶消化试验用于研究无细胞毛细血管和细胞，包括内皮细胞和周细胞。与对照组相比，糖尿病大鼠视网膜毛细血管扭曲，无细胞毛细血管数量显著增加。CaD和YQTLF治疗显著减少无细胞毛细血管数量。与对照组相比，糖尿病大鼠的内皮细胞与周细胞的比率（E/P）显著增加。结果表明，CaD和YQTLF治疗均显著降低E/P（图5）。

TUNEL染色检测视网膜细胞凋亡。与对照组相比，糖尿病大鼠的TUNEL阳性细胞数量显著增加。CaD和YQTLF治疗显著减少了凋亡细胞的数量（图6）。

与对照组相比，糖尿病导致ZO-1、occludin、claudin-5和VE钙粘蛋白水平显著降低。尽管ZO-1 mRNA没有显著差异，但CaD和YQTLF均增加了ZO-1、occludin、claudin-5、VE钙粘蛋白和mRNA水平。CaD和YQTLF的ZO-1和claudin-5蛋白水平、CaD的ZO-1、ZO-1 mRNA、YQTLF的ZO1和claudin-5 mRNA水平没有显著差异（图7）。

Western blot结果显示，与对照组相比，糖尿病大鼠的EZH2、SUZ12、EED、p38 MAPK、MMP-9和VEGFR表达水平显著升高。CaD和YQTLF治疗的糖尿病大鼠，p38 MAPK相关通路蛋白水平均显著降低。但YQTLF对PRC 2/p 38 MAPK通路抑制效果优于CaD（图8）。

RT-PCR结果显示与对照组相比，糖尿病大鼠的PRC2、EZH2、SUZ12、EED、p38 MAPK、MMP-9和VEGFR表达显著升高。CaD治疗的糖尿病大鼠中，EZH2、SUZ12、EED、p38 MAPK、MMP-9和VEGFR的mRNA水平均降低。YQTLF治疗的糖尿病大鼠中， EZH2、SUZ12、EED和p38 MAPK的mRNA水平降低，有显著差异；PRC2、MMP-9和VEGFR的mRNA水平降低，但无显著差异（图9）。

糖尿病大鼠的视网膜中，lncRNA MALAT1的表达与对照组相比显著增加。CaD和YQTLF治疗可抑制糖尿病诱导的lncRNA MALAT1上调（图10）。

采用酶联免疫吸附试验和WB来评估CaD和YQTLF对血清和视网膜中氧化应激和炎症因子的影响。与对照组相比，糖尿病大鼠血清中包括ROS、iNOS、NO和MDA的氧化应激因子显著升高，SOD和CAT显著降低。CaD和YQTLF治疗显著阻止了这种变化。与对照组相比，糖尿病大鼠血清中包括TNF-α和IL-1β在内的炎症因子显著增加，CaD和YQTLF的治疗显著降低了TNF-α和IL-1β的水平。YQTLF治疗组的炎症因子水平低于CaD治疗组。与对照组相比，糖尿病视网膜中的NF-kB p65和TNF-α蛋白水平均升高。CaD和YQTLF治疗均可降低糖尿病诱导升高的NF-kB p65和TNF-α蛋白（图11）。

本篇研究表明，益气通络方（TQTLF）能有效防治糖尿病视网膜病变，而且在保护和改善病理状态方面起着至关键作用。糖尿病视网膜中的BRB分解与炎症反应和氧化应激有关，YQTLF通过改善BRB的通透性，降低了炎症反应和氧化应激，因为TQTLF改善了糖尿病诱导的血清蛋白质中NF-κB p65、ROS、iNOS、NO、MDA、SOD、CAT、TNF-α和IL-1β的变化。

参考文献

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