16S+代谢组学 | 人参多糖改变肠道微生物群和犬尿氨酸/色氨酸比率，增强免疫疗法的抗肿瘤效果

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肺癌在全球范围内具有较高的发病率和死亡率。在所有肺癌中，大约80％–85％是非小细胞肺癌（NSCLC）。程序性死亡1（PD-1）抑制剂及其配体PD-L1是缺乏敏感性EGFR或ALK突变的转移性NSCLC的有效疗法。然而，即使将这些生物标记物用作金标准，其缓解率（< 25％）仍然不能令人满意，甚至导致过度进展性疾病（HPD）。因此，仍然需要针对大多数晚期NSCLC患者和更有效的一线治疗方法，以寻找可从中受益的患者。

目前世界范围内已经进行了广泛的研究，以确定PD-1 / PD-L1途径抑制剂与其他治疗药物或具有免疫调节作用的药物的新组合，这些药物或免疫调节作用可能会增强抗肿瘤反应。最近，肠道菌群激发了人们对癌症免疫治疗的极大热情 。已显示在临床前肿瘤模型和癌症患者中对癌症免疫治疗均具有良好的反应。因此，提出了调节肠道菌群的策略来治疗癌症患者，并作为新的反应预测生物标记物。

2021年5月澳门科技大学联合中山大学及澳门镜湖医院的研究团队在GUT发表的题为 “Ginseng polysaccharides alter the gut microbiota and kynurenine/tryptophan ratio, potentiating the antitumour effect of antiprogrammed cell death 1/ programmed cell death ligand1 (anti-PD- 1/PD-L1) immunotherapy”的研究成果，通过16S+代谢组学研究方法，发现了人参多糖改变肠道菌群和犬尿氨酸/色氨酸比例，增强抗程序性细胞死亡1 /程序性细胞死亡配体1（anti-PD-1 / PD-L1）免疫疗法的抗肿瘤作用。

人参已经在亚洲广泛使用了数千年，不仅作为药物而且还作为膳食补充剂。长期服用人参提取物已显示出可通过增加双歧杆菌，乳杆菌，梭状芽孢杆菌等的丰度来调节大鼠肠道菌群。人参包含许多活性成分，包括人参皂苷，精油，肽聚糖，多糖，含氮化合物，脂肪酸和酚类化合物。

PD-1 / PD-L1免疫疗法有望用于晚期肺癌治疗，但应答率有待提高。肠道菌群在免疫疗法致敏中起关键作用，人参已显示具有免疫调节潜力。在这项研究中，研究人员旨在研究人参多糖（GPs）和αPD-1单克隆抗体（mAb）的联合治疗是否可以通过调节肠道菌群来敏化应答。

研究人员还观察到外周和肿瘤组织中FoxP3 +调节性T（Treg）细胞的下调（图2E），而IHC谱在肿瘤组织中得到了一致的结果（图2F–K），这些结果表明联合治疗可能通过激活CD8 + T细胞并抑制Tregs的功能。

调节性T细胞（Tregs）是免疫抑制性肿瘤微环境的主要参与者，通常与不良的预后和生存率相关。临床研究已经确定了一组患者，这些患者可能因抗PD-1治疗而导致癌症的HPD（高度进展性疾病）风险增加。在研究人员的研究中，GP与αPD-1mAb联合使用可减少外周和肿瘤中FoxP3 + Treg的比例，这可能有助于预防HPD。总而言之，这些数据表明联合治疗具有增强的抗肿瘤免疫作用。

为了研究口服GPs是否会改变肠道菌群，研究人员对所有治疗组的粪便样本进行了16S rRNA测序。与单独使用αPD-1mAb的组相比，联合治疗后，微生物组成发生了变化，Muribaculum的丰度显著增加（图3A，B）。当与GP和空白对照组进行比较时，研究人员还观察到了Muribaculaceae的增加（在线补充图3），这表明GP可能具有丰富Muribaculaceae丰度的潜力。

为了进一步阐明肠道菌群与抗肿瘤作用之间的因果关系，研究人员评估了用抗生素治疗的带有LLC的小鼠的肿瘤生长，发现抗生素治疗损害了抗肿瘤功效（图3C，D）。在维持肠道免疫力方面，对结肠的组织病理学评估表明，联合治疗可减少结肠中炎性细胞的浸润（图3E，F）。IEL在维持屏障功能和降低对感染和免疫病理的敏感性中起着至关重要的作用。

为了研究联合治疗是否会影响IEL，研究人员采用了RNA测序技术来检查小肠中IEL的转录组变化。与单独使用αPD-1mAb的组相比，上皮内保护基因（CLCA3，Zg16，Pla2g10，Agr2，Guca2a和Tff3），28-30个与代谢相关的基因（Dgat2和Ces2a）和S100A6在联合治疗组的表达显著上调。相反，免疫球蛋白可变区重链基因（Ighv1-64，Ighv6-6，Ighv5-4，Ighv1-55，Ighv1-50和Ighv1-26），免疫球蛋白可变区轻链基因（Iglv2），免疫球蛋白κ可变表达在用联合疗法治疗的小鼠的IEL中，基因（Igkv4-68），Lrrk2，Camsap2，Myo5a，Bmf，Slc29a3和Mios被下调（图3G）。基因本体论（GO）分析表明，这些差异表达的基因主要与溶酶体，分泌颗粒和能量代谢有关，可以保护肠屏障的完整性（图3H）。与单纯使用GP组比较时，研究人员观察到了联合组的免疫应答相关的基因被上调（图 3I ，J ）。

联合治疗后，SCFA的丰度增加，IDO活性降低。为了研究SCFA的作用，研究人员使用超高效液相色谱-质谱（UPLC / MS）代谢组学检测了动物血浆中SCFA（乙酸，丙酸，丁酸，异丁酸，戊酸，异戊酸和己酸）的产生。有趣的是，研究人员发现，除乙酸外，用αPD-1mAb处理后，所有SCFA的丰度都增加了。值得注意的是，与单独使用αPD-1mAb的治疗组相比，联合治疗组的戊酸丰富度显著增加（图4A–G）。联合治疗可增加SCFA丰度并异常调节吲哚胺 2,3- 双加氧酶（ IDO ）活性。

除了 SCFA，研究人员还测量了 52 种氨基酸和脂肪酸代谢物的变化（在线补充图 4A）。并且观察到，与PD-1 mAb 单独治疗组相比，联合治疗组中 L-犬尿氨酸和 Kyn/Trp 比值（表示为 IDO 活性）显著降低，色氨酸代谢在这些代谢物中的贡献最大，但 L-色氨酸没有（在线补充文件4A–D，图4H-J)。结果表明联合治疗可能与 IDO 活性有关。

为了进一步研究肿瘤组织中的 IDO 活性，研究人员进了 IHC 染色，发现联合组中 IDO 的表达下调（图4K）。为了确定GPs对肠道微生物中色氨酸代谢的影响，通过体外分批发酵系统对GPs进行人粪便样品的元发酵。有趣的是，研究人员发现在好氧和厌氧发酵条件下，GPs 显著增加 L-色氨酸的产量并降低 L-犬尿氨酸的产量和犬尿氨酸/色氨酸的比例（在线补充表 1），表明 GPs 可以影响通过肠道微生物进行色氨酸代谢。

临床研究中纳入了16名中国NSCLC患者，并接受了抗PD-1阻断剂治疗。其中十名患者被澳门江湖医院的医师评估为有反应者（Rs），六名为无反应者（NRs）。这些患者的临床病理特征列在在线补充表2中。所有患者均接受了30个月以上的随访，并通过CT扫描监测其反应状态（在线补充图5A–C）。

为了研究肠道微生物组的组成是否与抗PD-1免疫疗法有关，研究人员收集了粪便基线样本，并对其进行了16S rRNA测序。肠道微生物组的α多样性表明Rs的丰富度和均匀度高于NRs（图5A）。在物种水平上，研究人员观察到Bacteroides vulgatus的相对丰度在Rs中居首位，并且三种肠道微生物的含量也过高：parabacteroidesdistasonis（p = 0.04），bacterium LF-3（p = 0.02）和Sutterella wadsworthensis HGA0223（p = 0.09；图5B–G，（在线补充文件5D–G）。有趣的是，对于那些具有更好响应和生存率的患者，这些细菌的丰度有所增加。

在研究人员的初始研究中，研究人员发现GP增强了LLC荷瘤小鼠中αPD-1mAb的抗肿瘤作用。GP是否可以逆转人类对αPD-1mAb治疗的反应尚不清楚；因此，研究人员设计了一个FMT实验来对其进行研究。将来自六个NRs的粪便微生物群转移到GF小鼠中。定居后，将LLC肿瘤细胞接种到小鼠中。然后，使用之前的小鼠操作方案治疗小鼠（图6A）。正如预期的那样，类似于NsR，研究人员发现小鼠对αPD-1mAb治疗具有抗性。有趣的是，当小鼠用GP加αPD-1mAb进行治疗时，反应得以恢复。联合治疗显著延迟了肿瘤的生长（图6B）。流式细胞仪分析和IHC分析表明，血液和肿瘤中CD8 + T细胞的CD8 + / CD4 +T细胞比例以及IFN-γ，TNF-α和GZMB的产生均增加（图6C–F，H–M ）。研究人员还观察到联合治疗组中的Treg细胞更少，这与治疗功效的改善相关（图6G）。同时，研究人员测定了小鼠血浆中色氨酸和犬尿氨酸的含量，发现联合处理后Kyn / Trp比值降低（图6J）。一致地，研究人员还观察到联合治疗后肿瘤组织中IDO的表达较低（图6K，L）。总体而言，这些数据表明 GP 可以使 LLC 小鼠中对 αPD-1mAb 的反应敏感。

同样，研究人员检查了联合治疗是否可以调节移植了NRs肠道菌群的LLC荷瘤小鼠的肠道菌群。令人兴奋的是，与αPD-1mAb和空白对照组相比，在联合治疗组组中，Bacteroides的丰富度，尤其是B. vulgatus和 P. distasonis中的含量显著增加（图6M，O，在线补充文件6A–C）。通过16S rRNA测序（在线补充文件7A–B）没有发现GF培养条件下的细菌污染，这些结果表明，联合处理可能会使NRs的肠道菌群重塑至Rs，从而增强对αPD的反应。

图7（A）GPs通过增强CD8 T细胞功能，增加IFN-γ和TNF-α的产生以及降低Treg在循环系统中的抑制作用来增强αPD-1mAb的抗肿瘤作用，这可以通过重塑肠道菌群来解决因此会影响色氨酸的代谢和SCFA。联合处理可增加含LLC小鼠的Muribaculum的丰度。联合治疗上调了CLCA3，TFF3，AGR2，Zg16，Pla2g10和Guca2a等上皮保护基因的表达。代谢产物SFCA和犬尿氨酸进入血液循环系统并增强免疫功能，从而抑制了肿瘤的生长并延长了生存期。

图7（B）联合疗法恢复了肠道菌群，这有助于将肠道菌群从无反应者恢复为反应者，从而增强了对αPD-1mAb的反应。通过16S rRNA测序发现，对pembrolizumab的应答者中，Parabacteroidesdistasonis和Bacteroides vulgatus含量较高。当通过粪便微生物群移植（FMT）将肠道微生物群从无反应者移植到无菌小鼠中，然后在定殖后接种LLC肿瘤细胞时，对小鼠进行联合治疗。

与αPD-1mAb和对照空白组相比，通过16S rRNA测序在组合组中发现了丰富的Parabacteroides distasonis和Bacteroides vulgatus。同时，联合疗法通过增强CD8 + T细胞的功能，增加IFN-γ，TNF-α和颗粒酶B的产生并减少Treg细胞来显著抑制肿瘤的生长。GP，人参多糖；IFN-γ，干扰素-γ；LLC，Lewis肺癌；mAb，单克隆抗体；IHC，免疫组化；NR，无响应；SFCA，短链脂肪酸；TNF-α，肿瘤坏死因子-α。总之，研究人员发现GP通过增强CD8 + T细胞功能和降低Treg的抑制作用来增强αPD-1mAb的抗肿瘤作用，这可能通过重塑肠道菌群和色氨酸代谢来解决，以提高免疫疗法的疗效。

研究人员发现GPs通过增加微生物代谢产物戊酸和降低L-犬尿氨酸以及Kyn / Trp的比例来增加对αPD-1mAb的抗肿瘤反应，这有助于抑制调节性T细胞并在诱导后Teff细胞诱导联合治疗。此外，微生物分析表明，在临床上对PD-1阻滞剂的响应者中，Parabacteroides distasonis和Bacteroides vulgatus的含量高于未响应者。此外，联合疗法通过将肠道菌群从无反应者重塑成有反应者而使从六只无反应者接受FMT的小鼠对PD-1抑制剂的反应敏感。因此，研究人员认为，GPs联合αPD-1mAb可能是使非小细胞肺癌患者对PD-1免疫治疗敏感的一种新策略。而肠道菌群可以用作预测抗PD-1免疫疗法反应的新型生物标志物。

参考文献 

1.Britton GJ, Contijoch EJ, Mogno I, et al. Microbiotas from humans with inflammatory bowel disease alter the balance of gut Th17 and RORãt Rãt+ regulatory T cells and exacerbate colitis in mice. Immunity 2019;50:212–24.

2. Nishitsuji K, Xiao J, Nagatomo R, et al. Analysis of the gut microbiome and plasma short-chain fatty acid profiles in a spontaneous mouse model of metabolic syndrome.Sci Rep 2017;7:15876.

3. Graf J, Ledala N, Caimano MJ, et al. High-resolution differentiation of enteric bacteria in premature infant fecal Microbiomes using a novel rRNA amplicon. mBio 2021;12. doi:10.1128/mBio.03656-20. [Epub ahead of print: 16 Feb 2021].

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END

小胡同学|撰文

小久|排版

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