项目文章 | 转录组+代谢组助力黑猪肉质研究

转录组和代谢组综合分析揭示恩施黑猪肉质复杂的分子调控网络

单位：华中农业大学

期刊：Meat Science

随着生活水平的提高，肉类品质已成为动物育种的重要目标。肉质是一个复杂的性状，通过一系列指标来综合评价，如肉色、肌内脂肪含量(IMF)、pH值、持水能力和嫩度。其中，IMF和肉色作为肉质的重要指标，对市场管理和育种计划具有影响和指导作用。

劣质肉类可能会造成巨大的经济损失，并增加人类疾病的风险，因此越来越多的研究旨在阐明脂肪形成和肉类变色的分子机制。然而，肉品质的生物学和分子机理的准确确定仍是一个挑战，需要新的方法来准确估计肌内脂肪含量和肉色，以提高生产效率。

近年来，多组学关联分析已被广泛应用于复杂性状和病害分析中，以探索其潜在的分子机制。转录组和代谢组学分析已被证明是研究肉质性状的有力工具，有助于通过多组学分析更好地了解肌肉调控机制。

恩施黑猪是我国重要的本土猪种，以其肉质弹性好、适应性强、储脂能力强等优良的生产特性而闻名；但肉质的过度多样化将严重影响销售、阻碍产业扩展。为揭示恩施黑猪肉质过度多样性的潜在分子机制，本研究对恩施黑猪的IMF和肉色性状进行了转录组学和代谢组学综合分析；旨在为恩施黑猪肉质遗传调控提供理论依据，为猪肉消费食品安全管理提供指导。迈维代谢为本研究提供了代谢组及转录组检测与联合分析。

4. 代谢组：IMF组(LF、HF组样本)进行动物广泛靶向脂质组检测；肉色组(LC、DC组样本)进行动物广泛靶向代谢组检测。

用于本转录组和代谢组研究的猪分别具有极端表型的IMF和肉色。根据IMF记录，选取5个HF个体(3头去势公猪和2头母猪)和5个LF个体(3头去势公猪和2头母猪)。同样，选取5个DC样品(3头去势公猪和2头母猪)和5个LC样品(2头去势公猪和3头母猪)进行肉色测定。如图1A-B,直方图显示HF组和LF组间 (mean_HF = 7.38%, SD_HF = 0.009, mean_LF = 1.33%, SD_LF = 0.001, p < 0.01)和DC和LC间(mean_DC = 16.12, SD_DC = 0.72, mean_LC = 10.59, SD_LC = 1.12, p < 0.01) 差异有统计学意义。

转录组差异表达分析在IMF和肉色中分别鉴定出120和141个DEGs，它们在极端表型组中的分布如图1C-D所示：HF组与LF组相比有79个基因表达上调，41个基因表达下调；DC组中与LC组相比，有52个基因表达上调，89个基因表达下调。热图如图1E-F所示描述了一致的DEGs的表达模式。在功能性DEGs列表中选取5个基因(IMF组的PNPLA3和CIDEC ;肉色组的NAMPT、AOX1和BPGM)通过qRT-PCR进行表达验证 (图1G)，结果显示差异有统计学意义，且变化趋势与RNA-seq数据一致。

图1.表型和转录组初步分析 (A) IMF表型比较 (B)肉色表型比较 (C) IMF组DEGs火山图 (D)肉色组DEGs火山图 (E) IMF组DEGs聚类热图 (F)肉色组DEGs聚类热图 (G) RT-PCR检测候选DEGs表达水平

在此基础上通过GO分析对基因进行功能注释和分类(图2A-B)。GO富集分析表明，富集度最高的GO term主要涉及脂肪相关代谢，如脂肪酸代谢、一元羧酸代谢和葡萄糖跨膜转运(p < 0.05)。在肉色组研究中显著富集的GO term主要是细胞周期进程的调节因子，如细胞外基质、核周期素依赖的蛋白激酶全酶复合物和蛋白激酶复合物羧基端结构域(p < 0.05)。为了进一步系统地研究表型分化的潜在生物学意义，基于KEGG生物信息库将所鉴定的DEGs注释到不同的通路中(p < 0.05)。根据在IMF中鉴定的DEGs，结果揭示了脂肪酸生物合成过程、脂肪酸代谢、糖酵解过程、糖异生活性等多个富集途径(图2C)；肉色组KEGG富集分析还得到了烟酸和烟酰胺代谢过程、cAMP信号通路、药物代谢-细胞色素P450过程等重要途径(图2D)。

图2. (A) IMF组DEGs的GO注释分析柱状图 (B)肉色组DEGs的GO注释分析柱状图 (C) IMF组中DEGs的KEGG通路富集示意图 (D)肉色组DEGs的KEGG通路富集示意图

为了研究恩施黑猪肉质多样性代谢产物组成的差异，采用LC-MS/MS对极端个体IMF和肉色进行分析。PCA和OPLS-DA分析显示各组间存在明显区别。根据|log2(fold change)|≥1,VIP值≥1筛选SCMs(显著变化代谢物)。在IMF组共筛选了171个SCMs：HF组167个SCMs丰度明显高于LF组，均属于二酰基甘油和三酰基甘油;HF组有4个SCMs丰度明显低于LF组。与IMF组相关的SCMs结果显示在火山图(图3A)中。肉色组：与LC组的代谢物相比，DC组共有47个SCMs发生了明显的变化，其中39个代谢物上调，8个代谢物下调（图3B）。热图结果(图3C-D)显示一致。

采用KEGG富集分析以帮助理解与表型变化相关的生物学机制。在IMF中，164个SCMs被显著注释为31个通路，其中大部分涉及脂肪相关通路，如胆固醇代谢、脂肪细胞脂解调节、维生素消化吸收、脂肪消化吸收等(p < 0.05;图3E)。肉色组32个SCMs主要分为86个大类，包括谷胱甘肽代谢、铁下垂和foxO信号通路(p < 0.05;图3F)。

图3. IMF和肉色组代谢组分析 (A) IMF组SCMs火山图 (B) 肉色组SCMs火山图 (C) IMF组SCMs的聚类热图 （TOP60）(D)肉色组SCMs聚类热图 (E) IMF组SCMs的KEGG通路富集示意图 (F) 肉色组SCMs的KEGG通路富集示意图

为了探索在转录组和代谢组数据中影响表型多样性的更多生物学信息，在这些变化中进行了相关检验和联合生物学注释，共包含IMF中鉴定的120个DEGs(79上调，41下调)和171个SCMs(167上调，4下调)。肉色组中有141个DEGs(52个上调，89个下调)和47个SCMs (39个上调，8个下调)。对这些基因和代谢物、及包含显著差异基因及其强相关SCMs进行通路注释，将在IMF或肉色相关调控中报道过的基因作为性状相关候选基因。

脂肪细胞和肌肉细胞的肌内脂肪代谢：综上联合IMF组的转录组学和代谢组学数据，差异基因及其强相关的SCMs被注释到几个重要的通路。

尤其是与肌内脂肪代谢相关的途径在，与LF组相比HF组的甘油脂代谢途径聚集了162个SCMs (6个二酰基甘油和156个三酰基甘油)均显著上调，同时该通路中PNPLA3基因（促进细胞脂质合成）在HF组中也表现出明显的上调；157个SCMs在脂肪细胞的脂解调控途径中富集，其中156个SCMs（都是三酰基甘油）增加；因此推测PNPLA3的活性表达可能导致甘油三酯的积累，最终通过调节甘油三酯和磷脂酰链的生成来影响IMF的水平。

相应筛选定位于脂肪细胞的脂解调控途径的PLIN1和PRKG1基因在HF组与LF组相比时均过表达；其中PLIN1被认为是通过阻止脂滴分解而调控脂滴形成和三酰甘油水解脂肪脂代谢的重要因子；PRKG1则通过其他重要的信号通路注释（包括产热作用和长期抑制）其表达与IMF中鉴定的36个SCMs高度相关(r > 0.7, p < 0.05，图4A)。

胰岛素抵抗被认为与体内甘油三酯的沉积有关，发现两个相关基因(TRIB3和CREB5)和156个甘油三酯代谢产物。在此过程中，TRIB3通过与Akt激酶结合阻断其激活，破坏了在能量代谢和脂肪沉积中起重要作用的胰岛素信号通路；而TRIB3和CREB5的表达影响肌细胞中苏氨酸蛋白激酶的激活和脂肪酸的水平，最终可能促进葡萄糖的合成。综上组合构建了相关途径网络（图4B）。

图4. SCMs相关分析和途径分析及与IMF性状相关差异基因的验证 (A)参与脂质代谢的候选基因PRKG1和共表达SCMs的Cytoscape互作网络图 (B) KEGG通路中富集的5个核心DEGs和相关SCMs的脂质代谢过程

烟酸和烟酰胺代谢在调节肉色中的作用：肉色研究注释到DEGs和它们高度相关的SCMs的重要性状相关途径主要包括烟酸、烟酰胺代谢和谷胱甘肽代谢。将与肉色相关的3个DEGs (AOX1, NAMPT和NMNAT2)注释到烟酸和烟酰胺代谢过程中，并检测到2个SCMs:烟酸腺嘌呤二核苷酸(NAAD)和В-烟酰胺单核苷酸(NMN)。其中，DC组AOX1明显升高而NAMPT和NMNAT2降低；在DC组中NAAD和NMN的丰度明显降低。这些差异基因与代谢物的相关性如图5A所示。烟酰胺相关网络如图5B所示。有报道称NMN在代谢调节和维持细胞自我修复能力方面发挥着重要作用。烟酰胺可以减少黑素体从黑素细胞向周围角化细胞的转移从而影响皮肤颜色，因此烟酰胺可能通过类似的代谢机制改变肉的颜色。

谷胱甘肽代谢与肉色密切相关，可能诱发猪的变色。MGST2基因具有谷胱甘肽转移酶活性，并能通过影响死后代谢（如ATP消耗和增强蛋白质变性）催化谷胱甘肽代谢过程中的各种谷胱甘肽依赖反应，最终对变色产生影响。MGST2的表达水平升高，代谢物l -谷氨酸、l -焦谷氨酸、Γ-glutamate-cysteine和甘氨酸含量上调。

图5. SCMs相关性和途径分析及与肉色性状相关差异基因的验证 (A)两个核心DEGs和两个关键SCMs之间的相关性 (B)两个核心DEGs和两个关键SCMs所在烟酸和烟酰胺代谢通路示意图

本研究基于转录组测序和LC-MS/MS系统进行转录组学和代谢组学分析，探讨影响IMF和肉色表型的复杂生物学过程。根据IMF组转录组数据和代谢组数据进行富集分析，揭示了本研究中脂肪生成和分解代谢等脂肪代谢过程相关的多条途径，功能基因PNPLA3、PLIN1、PRKG1、TRIB3、CREB5以及二十烷类和甘油三酯成分在脂质代谢相关过程中被筛选并显著富集；在肉色组研究中，通过转录组学和代谢组学数据的综合分析强调了烟酸、烟酰胺代谢和谷胱甘肽代谢是重要性状相关途径。以上结果将提供有效的信息和更多的证据以支持进一步深入了解肌内脂肪积累和肉色变化的生物学机制，研究结果可在遗传和分子水平上指导猪肉品质的改善。

本研究基于肉质的两个重要表型指标分别选择了适合的代谢组学检测技术（广靶和广靶脂质），进一步联合转录组学进行了相关性和功能通路双重分析验证并筛选了与不同指标相关的重要基因和代谢物，思路值得借鉴。