2021-05-19 17:40:23, 小迈 武汉迈特维尔生物科技有限公司
● 期刊:Redox Biology
● IF:9.986
● 发表时间:2021.03
● 单位:西安交通大学生命科学与技术学院
● 组学方法:迈维代谢广泛靶向脂质组
白色脂肪组织(White adipose tissue, WAT)被称为活跃的内分泌器官,是脂肪细胞的主要类型,对各种营养状态、胰岛素、炎症、衰老等进行调节。WAT增加是肥胖的显著特征,肥胖被认为是胰岛素抵抗和代谢综合征发病的驱动力。不同部位的WATs,在胰岛素抵抗中有不同的作用。在肥胖过程中都涉及脂肪酸合成酶(FASN)介导的脂肪酸从头合成。先前的研究发现,除细胞质FASN外,线粒体(mtFAS)中还存在第二种脂肪酸合成途径,虽然mtFAS通路上的每一步的酶已经完全确定,但这些酶在细胞活动中所参与的生理和病理作用仍不清楚。最近的研究充分证明mtFAS可以产生辛酰- ACP,这是一种在线粒体中合成硫辛酸的成熟前体,硫辛酸被认为是针对脂肪细胞功能治疗代谢综合征的可行策略,但内源性硫辛酸合成在调节脂肪细胞中的作用研究较少。
高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖和糖尿病小鼠模型,5-week-old雄性C57BL / 6 j小鼠被随机分为正常饮食和HFD小鼠,喂养8周后进行口服糖耐量试验和口服胰岛素耐量试验,确定糖尿病情况。小鼠恢复一周后禁食过夜并处死开展机制研究;对于遗传性肥胖和糖尿病小鼠,8周龄雄性db/db小鼠和具有C57BL/6遗传背景的ob/ob小鼠分别饲喂正常饮食2周,然后禁食过夜并处死开展机制研究。
1
肥胖和糖尿病小鼠脂肪细胞中Htd2的表达降低
为了探讨代谢紊乱条件下mtFAS酶的表达模式,作者引入肥胖和糖尿病小鼠模型。高脂喂养12周,体重增加、OGTT和ITT检测表明高脂血症小鼠存在明显的肥胖和糖尿病状态。检测多个组织中Hsd17b8、Cbr4、Mecr、Htd2、Mcat、Oxsm等mtFAS酶的基因表达水平,如图1所示,与正常饮食小鼠相比,HFD小鼠肝脏中Mecr和Htd2减少(图1A),而在肌肉中只有Htd2减少(图1B)。在棕色脂肪组织(BAT)中,HFD组Mecr、Htd2、Mcat显著降低(图1C), HFD组WAT中除Hsd17b8外,mtFAS表达普遍降低(图1D),揭示代谢紊乱时mtFAS通路普遍受到抑制。此外,还对遗传性糖尿病db/db小鼠进行了分析(图1E-H)。虽然mtFAS酶在肥胖和糖尿病动物的组织中表现出不同程度的抑制,但WAT中的Htd2 mRNA则表现出一致且显著的下降,表明Htd2在调节脂肪细胞代谢活性方面可能发挥重要作用。
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图1.
2
肥胖和糖尿病小鼠WAT中脂化蛋白减少
Htd2作为mtFAS中的酶之一,将3-羟基酰基- ACP转化为反式-2-烯丙基- ACP,作为MECR产生酰基- ACP的底物,酰基- ACP是内源性硫辛酸合成的已知前体(图2A)。虽然mtFAS的酶已经鉴定出来很长时间了,但mtFAS的脂肪酸产物仍然不确定,目前硫辛酸是唯一确定的副产物。因此,作者通过分析PDH和α -OGDH水平来评估HFD和db/db小鼠肌肉和WAT中硫辛酸的产生。如图2所示,仅肌肉中LA-PDH-E2显著降低,而LA-OGDH-E2未发生改变(图2B和C)。同时,在HFD和db/db小鼠的WAT中LA-PDH-E2和LA-OGDH-E2显著降低(图2D和E),表明代谢紊乱时WAT中mtFAS活性受到更显著的抑制。
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图2.
3
Htd2缺乏抑制了硫辛酸的产生,改变了3T3-L1细胞的脂质结构
为了进一步评估Htd2调控细胞活性的过程,作者首先通过免疫染色确认了Htd2的亚细胞定位。与之前的报道一致,Htd2定位于线粒体(图3A)。在3T3-L1细胞中,敲除Htd2基因,抑制了硫辛酸的产生(图3 B和C),mtFAS途径的关键酶、硫辛酸的副产物持续减少(图3 D和E)。脂质谱分析鉴定了938个脂质代谢物,共有35个代谢物显著变化,包括游离脂肪酸在内的6个代谢物降低(图3 F和G)。这一结果表明,抑制mtFAS可能对脂肪酸的从头合成影响较小,而改变的游离脂肪酸(24:2)是否为mtFAS途径的直接产物还需要进一步验证。此外,通过KEGG分析前25个差异代谢物,发现它们主要参与机体系统间的脂肪消化吸收与代谢的途径以及胰岛素抵抗(图3H),进一步支持mtFAS在调节脂肪代谢功能方面潜在的重要作用。
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图3.
4
Htd2缺乏引起线粒体功能障碍
在Htd2基因敲除后,显著改变的脂质大多上调,且这些上调的代谢产物在甘油三酯中富集(图3G),因此作者通过Nile染色验证了3T3-L1细胞的变化,结果显示在Htd2基因敲除后的细胞中脂滴明显增加(图4A)。此外,通过相关系数分析均显示,Htd2基因敲除后,下调的代谢物与上调的代谢物之间没有相关性,这表明可能有另外一个独立的生物学过程参与了脂质的积累。作者推测,甘油三酯升高是由于线粒体功能受到抑制而导致脂肪酸氧化受损。线粒体耗氧量分析结果显示,敲除Htd2基因可显著降低线粒体最大呼吸速率和ATP等(图4B)。有趣的是,进一步的分析表明,Htd2的下调特异性地降低了线粒体复合物I的活性(图4C),这可能是由于mtDNA编码的复合物I亚基表达降低所致(图4D)。这些数据表明mtFAS缺乏可引起严重的线粒体功能障碍,并可能导致其他脂质积累。
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图4.
5
补充硫辛酸可以恢复Htd2基因下调细胞的线粒体功能和抗氧化能力
硫辛酸是调节线粒体功能的关键元素之一,硫辛酸生物合成中断是mtFAS损伤的主要原因。因此,作者想知道补充硫辛酸是否可以恢复Htd2敲除细胞的线粒体功能。如图5A所示,在100 μ M时补充硫辛酸可以充分恢复Htd2敲除细胞的呼吸能力,同时增加细胞ATP水平(图5B)。同时,硫辛酸的补充也恢复了复合物I活性(图5C)。此外,Mitosox染色显示,在硫辛酸还原的Htd2敲除细胞中,线粒体产生的ROS显著增加(图5D),表明缺乏Htd2损害了复合体I的活性,从而通过减少硫辛酸的产生来促进氧化应激和功能障碍。
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图5.
因此,进一步敲除Htd2,同时补充硫辛酸剂,细胞中的谷胱甘肽水平降低,总SOD, Mn-SOD,和CuZn-SOD活动都恢复到正常水平(图6A- D)。与此同时,通过western blot发现,氧化蛋白在Htd2敲除后显著升高,硫辛酸补充后显著降低(图6E和F)。综上所述,复合体I功能障碍和氧化应激是Htd2缺乏相关硫辛酸减少的主要作用。
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图6.
6
mtFAS通路的抑制损害3T3-L1细胞的胰岛素敏感性
众所周知,线粒体功能障碍是胰岛素抵抗的关键因素之一。脂质组学分析还表明,Htd2抑制细胞中显著改变的脂质代谢产物主要与胰岛素抵抗有关(图3H)。进一步分析Akt磷酸化蛋白水平,发现Htd2敲除后p-Akt显著降低,硫辛酸补充后p-Akt水平显著升高(图7 A和B)。与此同时,GLU4的蛋白质水平在Htd2敲除的细胞中减少,硫辛酸补充后恢复(图7C和D)。因此,在胰岛素刺激下,Htd2敲除细胞的葡萄糖摄取受到抑制,硫辛酸补充可改善葡萄糖摄取(图7 E)。而3T3-L1被公认为前脂肪细胞。为了验证mtFAS通路在成熟脂肪细胞中的作用,通过慢病毒感染将3T3-L1细胞进一步分化为成熟脂肪细胞,并敲除Htd2。胰岛素诱导下Akt磷酸化水平通过下调Htd2持续下降,硫辛酸则有效改善(图7 F和G)。在GLUT4表达和葡萄糖摄取上也观察到类似的变化(图7H- J)。这些数据表明硫辛酸的产生是mtFAS通路与脂肪细胞胰岛素敏感性耦合的关键因素。
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图7.
采用广泛靶向脂质组学技术发现mtFAS缺陷细胞的脂质改变主要表现为甘油三酯的积累,这与线粒体功能障碍有关。本研究突出了mtFAS通路在调节线粒体功能和脂肪细胞胰岛素敏感性方面的关键作用。
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