项目文章 | 肠道微生物群介导的溶血磷脂酰胆碱生成促进肠上皮特异性Fut2缺乏症的结肠炎

炎症性肠病(IBD)是一种慢性炎症性胃肠疾病，是全球公共卫生关注的问题。人们普遍认为，IBD的病因是免疫反应失调，免疫反应与肠道微生物群和遗传易感个体的环境因素相互作用，这一点有待进一步探索。

近年来，全基因组关联研究(GWAS)提高了人们对IBD遗传力的认识，风险基因的清单也在迅速扩大。据最新报道，岩藻糖基转移酶2 (Fut2)的非分泌状态(缺乏Fut2功能性拷贝的个体被称为非分泌者)与克罗恩病(CD)易感性相关，但其机制尚不清楚。本研究重点针对Fut2基因做了深入研究。

Fut2和α-1,2-岩藻糖基化在IBD病患者和DSS诱导的结肠炎小鼠中下调

与健康人相比，CD和UC患者结肠组织中Fut2基因表达显著下调；所有5名CD患者和16名UC患者中的15人的Fut2低于对照组 (图1a)。UEA-I染色显示UC、CD患者的结肠上皮中α-1,2-岩藻糖基化减少(图1b)。此外，暴露于DSS的小鼠中，结肠组织中Fut2的蛋白水平显著低于正常小鼠(图1c，d)。通过UEA-I染色检测到暴露于DSS的小鼠结肠中α-1，2-岩藻糖基化减少(图1e)。上述数据表明，在IBD患者和动物模型中，Fut2和α-1，2-岩藻糖基化的表达降低。

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图1.

肠上皮特异性Fut2缺乏会加重DSS诱导的结肠炎

基于IBD中 Fut2和α-1,2-岩藻糖基化表达水平的降低，假设Fut 2在结肠炎中具有重要的功能相关性。为了评估Fut2在结肠炎中的作用，通过在饮用水中给予3% DSS 7天，在WT和Fut2^△IEC小鼠中诱导结肠炎。当用DSS处理时，Fut2^△IEC小鼠表现出比WT小鼠更高的死亡率(图2b)，伴随着结肠长度的减少(图2a)。并且Fut2^△IEC小鼠的疾病活动评分比DSS组的WT小鼠高得多 (图2c)。此外，这伴随着较短的结肠长度(图2d，e)。与临床症状一致，Fut2^△IEC小鼠结肠切片中更严重的腺体缺损、粘膜溃疡和炎性细胞浸润(图2f)和更高的组织病理学评分(图2g)进一步证实了该结果。总的来说，肠道上皮特异性Fut2丢失会加重DSS诱导的结肠炎。

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图2.

Fut2^△IEC小鼠表现出增加的炎症反应

炎症反应是评价结肠炎的重要指标，因此检测肠促炎细胞和因子。WT和Fut2^△IEC小鼠结肠组织中促炎因子无差异，但与WT组小鼠相比，暴露于DSS的Fut2^△IEC小鼠结肠组织中与巨噬细胞相关的促炎因子如tnf-α、il-1β、il-6的mRNA水平上调。此外，与单核细胞/巨噬细胞相关的趋化因子ccl2、ccl3也增加(图3a)。这一结果通过免疫印迹法进一步证实了白介素-1β和肿瘤坏死因子-α的表达(图3b，c)。F4/80免疫组织化学染色用于评估结肠巨噬细胞浸润(图3d，e)。显示巨噬细胞(F4/80 +) 是对照组的3倍。总之，这些结果表明Fut2缺乏增加了DSS诱导的急性结肠炎的炎症反应。

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图3.

肠上皮特异性Fut2的丢失加重肠屏障的损伤

结肠炎的严重程度也与上皮屏障损伤的严重程度相关。紧密连接是上皮屏障的重要组成部分之一，杯状细胞的分泌在上皮屏障中起着至关重要的作用。Fut2^△IEC DSS组上皮紧密连接的破坏程度明显高于其他3组。当暴露于DSS时，发现Fut2^△IEC小鼠的ZO-1和occludin(紧密连接的重要成分)的mRNA水平显著低于WT小鼠(图4b)。ZO-1和occludin的免疫荧光染色证实了这一结果(图4a)。此外，结肠组织的AB-PAS染色(图4c)显示，与DSS诱导的结肠炎中的WT小鼠相比，Fut2^△IEC小鼠的粘液厚度和杯状细胞数量(图4d)显著减少。简而言之，肠上皮中的Fut2缺乏加重了DSS诱导的结肠炎中的肠屏障损伤。

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图4.

肠道微生物群在结构和功能上发生了改变，溶血磷脂酰胆碱（LPC）水平在Fut2^△IEC小鼠中升高

由于如上所述检测到WT小鼠和Fut2^△IEC小鼠之间的差异，探索了介导结肠炎易感性差异的潜在因素。如前所述，Fut2对肠道菌群具有潜在的调节作用，因此推测肠道菌群可能是影响Fut2^△IEC小鼠结肠损伤的重要因素之一。第一步，使用小鼠粪便的16S多样性分析来探索基线和结肠炎期间的微生物群组成。Fut2^△IEC小鼠的α-多样性低于WT小鼠。当暴露于DSS时，与WT小鼠相比，Fut2^△IEC小鼠的Chao1指数下降更显著(图5a)。基于未加权均匀性的PCoA图(图5b)显示了四组微生物群之间的显著分离。如图5c所示，在用DSS处理的Fut2^△IEC小鼠中，木犀科和乳球菌科的相对丰度显著降低。在属水平上，与其他三组相比，用DSS处理的Fut2^△IEC小鼠中类杆菌的相对丰度增加(图5d)。

由于肠道微生物群的组成与其功能密切相关，接下来对粪便进行了非靶向代谢组学分析，以研究肠道微生物群的功能。值得注意的是，代谢组学分析显示，与WT DSS粪便相比，Fut2^△IEC DSS粪便中的胆碱代谢和甘油磷脂代谢途径显著增强(图5f)。这些数据表明WT小鼠和Fut2^△IEC小鼠的肠道微生物代谢功能可能不同。进一步分析了两种增强途径中的代谢物，发现与WT小鼠相比，Fut2^△IEC DSS小鼠中的LPC水平升高(图5g，h)。此外，PICRUST2分析表明，磷脂酶A (PLA)，负责产生脂多糖的微生物酶，在接受DSS的Fut2^△IEC小鼠中显著富集(图5i)。相关性分析显示，LPC的浓度与四种革兰氏阴性菌——埃希氏杆菌、嗜双胞杆菌、肠杆菌和戈登氏菌呈正相关(表1)。

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表1.

这些细菌的相对丰度在Fut2^△IEC DSS小鼠中增加(图5e)。总体而言，这些数据证明了WT和Fut2^△IEC小鼠之间肠道微生物群的结构和某些代谢途径不同，当暴露于DSS时，Fut2^△IEC小鼠比WT小鼠产生更多的LPC。

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图5.

 Fut2^△IEC小鼠的肠道微生物群促进LPC的生成加重结肠炎

为了证实LPC与肠道微生物群有关，进行了FMT试验。如图6a所示，接受来自Fut2^△IEC小鼠的粪便微生物群的小鼠(FMT-F组)显示出比接受来自WT小鼠的粪便微生物群的小鼠(FMT-WT组)更大的体重减轻。在FMT-F组察到更高的DAI评分(图6b)和更短的结肠长度(图6c，d)。结肠切片的苏木精-伊红染色显示，在病理学上，FMT-F鼠的结肠炎比FMT-WT小鼠更严重。此外，免疫荧光染色显示，与另一组相比，来自Fut2^△IEC小鼠的粪便微生物群降低了结肠中ZO-1和occludin的表达(图6f)。、促炎因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β在FMT-F组更高(图6g)。最重要的是，FMT-F小鼠的粪便LPC浓度高于FMT-WT小鼠(图6h)，这证实了LPC与肠道微生物群的关联。

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图6.

LPC加重DSS诱导的结肠炎

为了LPC是否会加DSS诱导的结肠炎，将小鼠随机分为两组。两组小鼠均在饮用水中暴露于1% DSS 7天，DSS + LPC组小鼠也给予LPC (40 mM，溶于PBS)灌肠，每天1次，共7天；DSS + PBS组给予PBS作为对照。如图7a所示，与只接受DSS的小鼠相比，DSS + LPC小鼠在实验结束时表现出明显更多的体重减轻。在DSS + LPC组中观察到更高的DAI分数(图7b)和更短的结肠长度 (图7c，d)。结肠组织的组织病理学分析(图7e，f )证实了LPC加重DSS诱导的结肠炎。

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图7.

LPC增加体外和体内的炎症反应

炎症反应是评价结肠炎严重程度的一个重要指标，因此检测了DSS + PBS和DSS + LPC小鼠结肠组织中炎性细胞因子的mRNA和蛋白水平。肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、ccl2和ccl3的基因表达在接受LPC处理的小鼠中增加(图8a)。肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β在DSS + LPC小鼠中的蛋白表达是DSS + PBS小鼠的2-3倍(图8b，c)。此外，与DSS + PBS小鼠相比，DSS + LPC小鼠的血清LPS水平增加(图8c)。在体外，与未经DMSO处理的细胞相比，用LPC (50uM)处理12小时的Raw 264.7细胞显示出包括tnf-α、il-1β、ccl2和ccl3在内的促炎细胞因子的显著增加。在DMSO+LPC组中，ccl4和ccl5的基因水平也高得多(图8e)。同时，用LPC处理的Raw 264.7细胞在上清液中分泌更多的促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β (图8f)。总之，LPC促进了结肠炎症反应。

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图8.

LPC损害体外和体内的紧密连接

为了进一步确定LPC对上皮屏障完整性的影响，检测到ZO-1和occludin的mRNA和蛋白水平在DSS +LPC小鼠中显著低于在DSS + PBS小鼠中的水平(图9a-c)。结肠组织的免疫荧光染色显示ZO-1和occludin的表达被LPC破坏(图9d)。与DSS + PBS小鼠相比，DSS + LPC小鼠的杯状细胞数量显著减少，粘液厚度也显著减少(图9e，f)。相应地，在体外，在不同的时间点(0、12、24小时)在Caco-2细胞中测量两组(DMSO和DMSO+LPC)的TEER。实验开始时，两组之间没有发现差异。然而，在12和24小时处理后，DMSO+LPC的TEER值与DMSO相比显著降低(图9g)。此外，用LPC处理的caco-2细胞中ZO-1和occludin的mRNA和蛋白水平是另一组的一半(图9h，I，j)。ZO-1和occludin的免疫荧光显示当用LPC处理时，caco-2细胞的紧密连接被破坏。

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图9.

我就知道你“在看”