开年封面文章 | 蛋白组学与代谢组学“联手”发现糖尿病肾病（DKD）标志物！

2021年11月，南京中医药大学附属医院江苏省中医院单位（一作刘史佳研究员）及其课题组在Molecular Metabolism期刊发表的题为“Serum integrative omics reveals the landscape of human diabetic kidney disease”的研究成果，通过TMT标记定量蛋白组学和GC-MS非靶代谢组学研究方法，发现了糖尿病肾病（DKD）特征，筛选了蛋白和代谢组合生物标志物。为优化糖尿病肾病（DKD）管理提供了丰富且开放访问的数据资源。

  图 | 封面文章

糖尿病（DM）影响了全球约4.63亿人，而且这一数字还在继续增长。糖尿病不仅会造成器官损伤，还会导致多种并发症，糖尿病肾病（DKD）就是常见的糖尿病并发症之一。现在，糖尿病肾病（DKD）已经超过肾小球肾炎，成为导致慢性肾脏疾病（CKD)和终末期肾病（ESRD）的主要原因。虽然已有研究涉及该邻域，但对糖尿病肾病（DKD）的发病机制了解得并不完善，同时现有的诊断方式（仅根据临床信息）并不能准确地帮助医生区分真正的糖尿病肾病（DKD），非糖尿病肾病以及复杂型糖尿病肾病。与基因组学相比，蛋白质组学和代谢组学有可能为DKD的进展机制提供新见解。并且结合这两种组学来筛选标志物可能可以提高DKD诊断的准确性。

1. 蛋白质组学破译DKD在2-DM（二型糖尿病）中的进展

每组随机选30个血清样本，10个同组样本混合成一个上样样本，总共检测了12个上样样本（4组）。原数据经过预处理和缺失值过滤后，使用581种蛋白质进行后续分析。独创性通路分析（IPA）表明，差异蛋白参与了肝脏X受体/类视黄醇X受体（LXR / RXR）激活，法尼体X受体/类视黄醇X受体（FXR / RXR）激活和急性期反应信号传导。

通过ELISA在发现队列的88名参与者的实验来测试这些蛋白能否区分DKD程度，验证了8种主要蛋白：脂联素、α2-巨球蛋白（α2-M）、组织蛋白酶D、CD324、脂肪酸结合蛋白1（FABP1）、磷脂转移蛋白（PLTP）、性激素结合球蛋白（SHBG）和组织抑制剂基质金属蛋白酶1（TIMP-1），偏最小二乘判别分析（PLS-DA）结果显示，这8种蛋白可以区分四个分组。再通过机器学习算法，发现α2-M，组织蛋白酶D和CD324可作为潜在的生物标志物组合。但准确区分2-DM和DKD-E仍然是一个挑战。

图1 | 蛋白质组学破译了DKD的状态

（A） 从参与者那收集蛋白质组学数据的工作途径。

（B） 来自蛋白质组学数据的生物标志物检测热图。每行代表一个蛋白质标记物，每列代表四组（包括HC，2-DM，DKD-E和DKD-A）的上样样品。蛋白质标记物通过分层聚类分为四个簇。

（C–F）对应于所示四个簇的蛋白表达图 1B.这四个集群分别呈现出下行、上平、上行和下行模式。

（G–K）每个成对比较的蛋白质组学数据的火山图。x轴是 log2 折叠变化，y轴表示减对数 10 p值。过度表达和表达不足的蛋白质分别标有红色和蓝色。

（L） 网络图，说明差异表达蛋白检测到的富集通路。每个节点代表一种蛋白质，蛋白质通过其所涉及的途径连接。

（M） 基于ELISA标记的偏最小二乘判别分析。

（N） 小提琴图通过ELISA说明了每组α2-巨球蛋白、组织蛋白酶D和CD324的浓度。

2.血清中差异表达代谢物的成对比较   

使用GC-MS非靶向代谢组学对发现队列的1102名参与者的代谢物进行分析，总共鉴定到207种代谢物。对差异代谢物进行了非参数Wilcoxon检验，并且对排名靠前的上调和下调代谢物分析，鉴定到乳酸、甘油-3-半乳糖苷、内消旋赤藓糖醇、D-（+）-木糖、甘油和（+-）3-甲基-2-氧代戊酸。对它们进行PLS回归分析，发现它们可以有效地分离比较组。

对每个比较组种差异代谢物进行通路分析，来确定这些代谢物在2型糖尿病和DKD中的生物学意义。分析表明甘油脂代谢、戊糖和葡萄糖醛酸盐相互转化以及半乳糖代谢是受影响最大的途径。

图2 | 通过成对比较DKD状态来检测差异表达的代谢物

（A–E）显著上调代谢物的代表性箱形图。

（F–J）显著下调代谢物的代表性箱形图。

（K–O）基于差异表达代谢物的偏最小二乘判别分析。

（P–T）根据差异表达的代谢物涉及最重要的重要功能途径。

3.血清中差异代谢物相关性网络

为了研究代谢物的改变对DKD不同阶段的影响，进行了通路和相关性网络分析。根据差异代谢物在不同组中的中位表达，把它们可以分为两类：第一类是在HC、2-DM和DKD-E中表达量相对低；另一类是在DKD-A中相对表达量低。使用PLS-DA进一步分析，四个组能很好地被分开。通路分析表示，戊糖和葡萄糖醛酸盐相互转化、半乳糖代谢和甘油脂代谢排在前面。网络分析表明与2-DM和DKD发展相关的关键代谢物（如甘油，半乳糖等）在四组中发生了显著变化。

图3 | DKD代谢物生物标志物鉴定

（A） 差异表达代谢物的分层聚类。热图中现实的每组代谢物的中位表达水平。

（B） 四个组的偏最小二乘判别分析。

（C） 由差异表达代谢物检测到的重要途径。

（D） 基于差异表达代谢物的网络分析。

4.通过血清中代谢物的表达成对地预测DKD的机器学习

使用五种机器学习算法（LDA,SVM,RF,Logi和偏最小二乘判别分析），生成的ROC曲线显示HC与2-DM、HC与DKD-E、HC与DKD-A、2-DM与DKD-A、DKD-E与DKD-A的预测精度分别为75%、82%、93%、90%和84%（图4A-E）。

然后在内部队列和三个外部测试集中进行验证，不同比较组的模型在不同测试队列中不同，有些队列的准确性比较低。与蛋白标志物一样，代谢物不能很好地区分2-DM和DKD-E。根据6个临床数据，可将2-DE分为5个亚型，重新分组了参与者，发现血清代谢物在五组中显示出明显地特征。总的来说，这些代谢物可以预测2-DM和DKD状态，特别是早期和晚期状态。

图4 | 通过代谢组学数据的机器学习算法预测DKD状态

（A–E）通过五种不同的机器学习方法对每个接收器的工作特性（ROC）曲线进行成对预测。

（F–J）通过随机森林杂质测量选择的主要预测特征。

（K–O）基于随机森林算法的预测概率。

5.蛋白质组学和代谢组学的整合提高了DKD的诊断价值

作者进行了综合分析，将蛋白组学和代谢组学中的显著生物标志物合并到通路分析中，并确定了半乳糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸盐相互转化、柠檬酸盐循环和丙酮酸代谢这几种途径。然后结合蛋白质和代谢标志物来预测DKD状态。五种机器学习模型表明，组合模型提高了DKD预测的准确性和稳定性。图中展示了RF的结果。总的来说，组合多组学标志物模型是一种强有力的提高DKD诊断的方法。

图5 | 蛋白质组学和代谢组学数据的综合分析

（A） 差异表达的蛋白质和代谢物检测到的重要途径。

（B） 成对预测精度基于仅蛋白质特征（蓝色）、仅代谢物特征（红色）以及蛋白质和代谢物特征整合（橙色）。

（C） 热图为预测精度。热图像元中的数字表示真实情况与预测事例的比率。

（D） 当整合ELISA和代谢物特征时，随机森林模型对所有发现队列训练的预测树。

（E） 基于随机森林算法的杂质测量对ELISA和代谢物特征进行排名。

（F） 在整合 ELISA 和代谢组学数据时，基于五种机器学习算法区分 2-DM 和 DKD-E 的预测精度。

6.甘油-3-半乳糖苷是检测DKD发展的生物标志物

通过分析差异表达的代谢物和每个患者的临床参数之间的相关性，发现血清甘油-3-半乳糖苷与患者的eGFR和血清肌酐相关，还发现该物质可能是DKD发展的血清标志物。甘油-3-半乳糖苷的合成过程如图所示，结合其他研究讨论了它可能在DKD中的机制。综合数据表明血清蛋白α2-M/组织蛋白酶D/CD324和甘油-3-半乳糖苷的变化可能是确定DKD发病和进展的有效生物标志物。

图6 | 甘油-3-半乳糖苷的合成是DKD进程中一个独立的代谢事件

（A–-B）甘油-3-半乳糖苷与eGFR或血清肌酐（Scr）水平之间的相关性。

（C）示意图描述了甘油-3-半乳糖苷的合成过程及其在DKD发病中的作用。

该研究一共从4个独立的医疗中心招募了1513名参与者，包括健康成年人（HC）、2-DM、早期糖尿病肾病（DKD-E)和晚期糖尿病肾病（DKD-A），并建立了一个发现队列和四个测试队列。总的来说，通过对参与者的血清进行蛋白组学和代谢组学研究主要得出三个结果：

1. 蛋白组学结果表明，α2-巨球蛋白、组织蛋白酶 D 和 CD324可作为检测DKD进展的潜在生物标志物。

2. 代谢组学结果表明，半乳糖代谢和甘油脂代谢是DKD的主要代谢途径，此外甘油-3-半乳糖苷可作为预测DKD的独立标志物。

3. 蛋白组学和代谢组学的组合可以提高预测和诊断DKD的准确性和稳定性。

血清综合组学的生物标志物可用于DKD的预警和诊断。该研究为优化DKD的管理提供了数据资源。

通过TMT标记蛋白组学和GC-MS非靶代谢组学研究健康组和不同程度患病组的差异，找到可能影响疾病或者改变的生物途径。找到的差异代蛋白质和代谢物可作为疾病诊断的生物标志物，单独的生物标志物诊断效果往往有限，多组学多指标组成的综合型标志物可以很好的提高诊断效果。为临床的诊断和疾病的管理提供一种强有力的方法。

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Lemon 撰文

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