项目文章 | 运用非靶代谢组学、靶向代谢组学技术研究丙酮酸胁迫对葡萄酒品质的影响

2021年9月暨南大学白卫滨课题组在Food Chemistry发表了题为 “Pyruvic acid stress caused color attenuation by interfering with anthocyanins metabolism during alcoholic fermentation”的研究成果，通过非靶代谢组学、靶向代谢组学等技术研究丙酮酸胁迫对葡萄酒品质的影响，发现丙酮酸过量会干扰酒精发酵过程中花青素的代谢，从而影响葡萄酒色泽。

花青素属于酚类化合物，负责开花植物不同部位的色素沉着，如花、果、叶、茎和根。富含花青素的果酒以其宜人的色泽和优越的功能对消费者具有迷人的吸引力。因此，色泽流失严重威胁果酒的品质，颜色强度和色调是酿酒师关注的问题。研究表明，葡萄酒生产链中绝大多数的花青素降解都归因于发酵过程，酵母通过糖酵解和无氧呼吸促进了酒精的产生，并对花青素进行了修饰和降解，酵母发酵的代谢中间体参与了与花青素衍生物生成有关的各种反应。因此，酵母引起的花青素变化对于高质量的葡萄酒生产至关重要。

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1. PA胁迫下酵母发酵过程中的颜色变化

作者对5株酿酒酵母（2323，D254，RC212，VL1，Angel）在丙酮酸（PA）胁迫下发酵过程中的颜色变化进行了研究。结果显示，与没有PA的组相比，PA组的颜色明显下降（图 1），这表明PA胁迫对富含花青素的葡萄酒系统发酵期间的颜色性能产生了不良影响。与C3G-PA组和C3G单独组相比，PA添加不影响颜色性能。与无PA组（酵母-C3G）相比，对酵母（酵母-C3G-PA）的PA应激容易产生颜色损失。这些结果表明PA胁迫下的颜色损失主要与红色值的降低有关。

图1 | 第0、2、4和6天发酵液颜色变化

2.PA胁迫对酵母生长、β-葡萄糖苷酶活性及酵母细胞壁吸附的影响

作者检测了发酵过程中糖的变化和酵母细胞的生长情况，发现过量的PA不影响正常的糖酵解。PA干扰对酵母细胞繁殖也没有影响，表明颜色变化不是由酵母细胞的过度增殖引起的。通过pNPG方法测定了β-葡萄糖苷酶活性。结果表明，PA补充后发酵液中β-葡萄糖苷酶活性没有发生显著变化。随后作者将5天发酵后收集的沉淀物冻干以进行吸附花青素定量，发现PA的参与并没有使酵母细胞壁具有花青素吸附的多余能力。

3.花青素及其衍生物在PA胁迫下的变化

作者测定了发酵液中的C3G浓度，无PA和PA应激组的1天内，C3G均存在沉淀降解；与无PA组相比，PA应激可以从第2天到第5天显著降低C3G浓度。该数据验证了PA在发酵过程中直接参与C3G的降解加剧。

为了更好地了解花青素代谢的途径，作者使用UPLC-TOF-MS / MS鉴定并量化了发酵过程中花青素的变化情况。结果表明，花青素在发酵8小时后首次可检测到，并剧烈生长至16 h，这与C3G的降低呈负相关（图 2）。随后分析了三种花青素（C3G、矢车菊素和葡萄球菌素B）与红色值之间的颜色相关性，以破译褪色性能，结果表明葡萄酒颜色变浅可能归因于较低的丰度C3G和花青素。

图2 | 花青素及其衍生物在发酵过程中的变化

4.PA胁迫下花青素的降解变化

作者对花青素降解产生的代谢物进行定性和定量测定，PC和TB作为C3G的主要降解产物，在发酵的前12小时快速增加，随后波动下降；PA胁迫对发酵液中PC和2，4，6-三羟基苯甲醛的含量没有显著影响（图 3）。

图3 | 花青素及其衍生物在发酵过程中的变化

5.发酵液的非靶向代谢组学分析

作者对4组发酵液（酵母，酵母-PA，酵母-C3G，酵母-C3G-PA）进行非靶代谢组学检测，共鉴定到339种代谢物。在糖酵解过程中，PA应激明显地促成了从6-磷酸葡萄糖酸到糖原的更多转变和糖原的增加；当将酵母-PA vs酵母和酵母-PA-C3G vs酵母-C3G进行比较时，发现糖酵解和TCA循环方面存在类似的变化。作者发现花青素在酒精发酵过程中变化的机理包括花青素去甘氨酸基化、矢车菊素的形成、PC和TB生产的开环反应以及花青素衍生物产生的异构化；PA应激可以通过促进C3G转化为矢车菊素、葡萄素A、矢车菊素-3-O-（3′-异丙二）-葡萄糖苷来损害C3G的浓度，以及通过加速其异构化为多种类黄酮来削弱花青素的浓度。这些全面的变化共同导致最终的颜色衰减。

图4 | 发酵液的非靶向代谢组学分析

作者研究发现丙酮酸过量会导致葡萄酒颜色变浅，但丙酮酸干扰对酵母细胞繁殖和β-葡萄糖苷酶活性均无显著影响，随后通过非靶代谢组学、靶向代谢组学等技术研究丙酮酸干扰过程中葡萄酒代谢物的变化，发现丙酮酸过量会干扰酒精发酵过程中花青素的代谢，通过加速其异构化来削弱花青素浓度，从而影响葡萄酒色泽，因而在葡萄酒生产中过程中应避免丙酮酸过量。

通过非靶代谢组学技术，能够了解发酵过程中，发酵液代谢物的变化情况。了解到在糖酵解过程中，多余的PA会扰乱糖酵解和三羧酸循环的过程，从而深入了解葡萄酒发酵过程中颜色变化的原因。

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叮当 撰文

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