Nat Com | 空间代谢组学助力医科院药物所蒋建东团队探究靶向纳米技术促进小檗碱肝脏吸收机制

中国医学科学院药物研究所蒋建东团队课题组在Nature Communications发表了题为“Liver-target nanotechnology facilitates berberine to ameliorate cardio-metabolic diseases"的研究成果，通过AFADESI-MSI空间代谢组学、Western Blotting、RT-PCR、Flow cytometry和ELISA等技术研究BBR-CTA-Mic对高脂饮食小鼠的代谢紊乱和动脉粥样硬化治疗效果，发现BBR-CTA-Mic不仅可有效促进肝脏沉积和肝细胞摄取BBR，还能降低血浆中的脂质和促炎细胞因子。

心血管和代谢疾病（CMD）是引起全世界人口过早死的主要原因。CMD有较高的发病率和死亡率，且医疗成本越来越高。

小檗碱（BBR）是一种具有多种抗代谢紊乱功效的降脂植物化合物，存在于各种植物的根、茎、果实和树皮中，如黄连、水螅和小檗。在许多国家，它已经被批准用于治疗高脂血症，并已在欧洲心脏病学会和欧洲动脉粥样硬化学会（ESC/EAS）指南中被建议作为肝损伤或对他汀类药物不耐受患者的常规他汀类药物的替代疗法。现有的研究表明，BBR对心血管损伤的各个阶段有多种积极的多效作用，如调节血压、促进心脏功能、改善内皮功能和动脉硬化、抗血小板、抗血栓形成原和抗心律失常等。BBR被认为是治疗CMD的有力候选者，肝脏是BBR的主要作用靶点，因此肝脏部位的积累对于实现其治疗效果尤为很重要。

研究表明，BBR的生物利用度较低，需要高剂量的BBR才能达到治疗效果，但高剂量剂量可能会伤害身体。因此，构建了D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯胶束（TPGS-Mics），来可以提高BBR的渗透性和生物利用度，但这种胶束在生理环境下不稳定。所以，作者设计了一种载脂蛋白载体（CTA-Mic），以期提高BBR在肝脏的积累量。

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1. BBR-CTA-Mic的制备与表征

首先制备D-α-生育酚聚乙二醇-硫醇琥珀酰胺（TPGTSA），并采用H NMR和13C NMR光谱（500 Hz、400 Hz）、傅立叶变换红外光谱和MALDI-TOF质谱仪对其化学结构进行表征，然后制备BBR-CTA-Mic。结果表明，CTA-Mics形态似球形（图1 b，上），大部分BBR分布在疏水核内，并沿着胶束冠内某些中间位置的表面活性剂分子分布，BBR加载不影响均匀胶束大小，对PS、PDI和ZP状态影响最小（图1 b，下）。在本项研究中，与BBR-TPGS-Mic相比，BBR-CTA-Mic表现出更小的平均直径、相似的ZP和更高的载药量。

通过记录模拟生物液体中PS和PDI随时间的变化来评估BBR-CTA-Mic的稳定性。结果表明，组合核心中的交联外壳确保了BBR-CTA-Mics在生理条件下的稳定性。与稳定性分析的结果一致，在SGF、SIF或SS条件下，BBR-TPGS-Mics释放的BBR比BBR-CTA-Mics释放的BBR多（图1 c）。无论测试释放介质的pH值或组成如何，BBR-CTA-Mics在一段时间内都显示出缓释相，这反映了由于载体强度提高而具有更高的药物掺入稳定性。在暴露于20%肝匀浆时检测到BBR-CTA-Mics中BBR的突然释放，证明了BBR-CTA-Mics对肝细胞细胞内环境的敏感性。

图1 | TPGTSA和BBR-CTA-Mic的表征

2.BBR-CTA-Mics可帮助药物吸收，且不刺激肠道

作者通过BBR制剂在Caco-2细胞系中的三维跨上皮转运研究（图2），推断出外排转运蛋白参与了BBR跨上皮转运。BBR加CTA-Mic混合物（BBR/CTA-Mics）组的结果与BBR-S组相似，表明加入CTA-Mic不会影响BBR的肠道运输。为了进一步解释跨上皮转运特性的机制，作者评估了P-gp抑制剂环孢菌素A（CsA，10μM）对含有BBR的样品转运的影响。暴露于CsA后，BBR-S的Papp（A-B）增加，而Papp（B-A）减少，证实P-gp参与了BBR的外排。BBR/CTA-Mic组也获得了类似的结果。相比之下，暴露于P-gp抑制剂不影响BBR-CTA-Mic组中BBR的跨上皮转运。

随后，作者在不同的BBR配方中评估了P-gp的底物试剂（Rho123，10 μM）的跨上皮转运。如图1 d（下）和图2 D所示，通过添加CsA，Rho123的B-A运输减少到22.1%，而添加BBR-CTA-Mic后没有发现显著差异。然而，发现添加BBR/TPGS-Mic、BBR-S、BBR/CTA-Mic或BBR-TPGS-Mic可通过P-gp抑制增加Rho123的吸收，这与之前的报告一致。超离心过滤器用于测试通过单层运输后胶束的完整性。如图3所示，超过50%的BBR-CTA-Mic以其完整的形式穿过单层，而几乎所有常规的BBR-TPGS-Mics在运输过程中都坍塌了。

图2 | 跨上皮转运研究

图3 | 经上皮转运后BBR制剂的完整性评估

3.BBR-CTA-Mics增强HepG2细胞药物积累

在肠道吸收后，肝脏是BBR从门静脉短暂经过后进入的第一个器官。使用激光共聚焦显微镜（CLSM）测试BBR-S、BBR/CTA-Mic和BBR-CTA-Mic在肝细胞的内化情况（图4），结果表明BBR通过包封在CTA-Mics中提高了药物在肝细胞中的渗透和积累。此外，还在肝细胞中测试了常规BBR-TPGS-Mic的细胞摄取（图5），并研究了BBR-CTA-Mic的内吞机制。

先前的研究表明，P-gp外排促进了肝脏中BBR的消除，从而抵消了它们的治疗效果。因此，作者使用基因操纵技术进一步研究了P-gp外排泵对BBR的驱散，结果表明P-gp是BBR外排的主要动力，BBR-CTA-Mic可减少P-gp介导的BBR外排。D-α-生育酚琥珀酸酯可以阻断P-gp介导的药物流出。包封药物的细胞内摄取增加和P-gp流出减少可能有助于药物在肝细胞中的积累。

图4 | 细胞内摄取分析

图5 | 细胞内吸收分析

4.BBR-CTA-Mics促进了BBR在肝脏的沉积

活性部位内的良好保留对于药物发挥其治疗功效很重要。肝脏是BBR的主要目标。在这项研究中，比较了BBR-S或BBR-CTA-Mic灌胃给药后BBR在体内的时间依赖性生物分布。通过IVIS成像（图6 A）和LC-MS/MS（图6 b）测试的结果表明，与其他器官相比，BBR在肝脏中的分布更高。在BBR-S组，BBR在治疗后2 h达到最大浓度（Cmax），随后迅速下降；然而，BBR-CTA-Mic不仅增加了Cmax，而且延长了BBR在肝脏中的保留时间。进一步检查了肝组织中的BBR水平。

荧光成像（图6 c）和AFADESI-MSI空间代谢组学（图6 d）结果证实BBR-CTA-Mic组与BBR-S组相比BBR在肝组织中维持在较高水平和较长时间。BBR-CTA-Mic组中肝脏药物浓度升高可能是由于CTA-Mic辅助肠道吸收和肝细胞吸收的改善。值得注意的是，肝脏中BBR积累的升高（+248.8%）远高于血浆（+99.1%）和其他主要器官中的水平，清楚地表明BBR-CTA-Mic可以最佳地辅助BBR积累肝脏，从而提高其治疗效果。BBR-CTA-Mic的肝细胞分布图显示，CTA-Mic系统提高了肝细胞中BBR的含量，而肝脏非实质细胞（如库普弗细胞、肝窦内皮细胞、单核细胞等）摄入的药物减少或没有受到输送系统的显著干扰，这种效果可能有益于活性BBR的治疗效果。

图6 | 生物分布评价

5.BBR-CTA-Mics在体外激活代谢相关基因

在用含有BBR的制剂处理后，分析了HepG2细胞中一系列能量代谢相关基因的表达。如图7 a所示，在用BBR-CTA-Mic处理后，InsR、p-AMPK和LDLR蛋白同时激活，表明其基因调控效应。结果经过通过FCM分析验证。此外，还检测了InsR、LDLR、AMPK和AKT基因的mRNA水平，以及InsR、p-InsR、LDLR、AMPK、p-AMPK、AKT和p-AKT的蛋白质水平，以进一步解释基因调控BBR-CTA-Mic的效果。

如图7 b所示，加入BBR制剂后，InsR、AMPK和LDLR基因的mRNA表达升高。在用BBR制剂干预后，InsR、p-InsR、LDLR、AMPK和p-AMPK的蛋白质表达也增加（图7 c）。结果与之前的报告一致。p-AMPK/AMPK和p-InsR/InsR的比率也增加。BBR制剂不会增加HepG2细胞中AKT和p-AKT的表达，这与先前的发现一致，即仅当存在胰岛素时，BBR才会激活AKT。当BBR浓度相同时，相对于BBR-S和BBR/CTA-Mic，BBR-CTA-Mic对这些基因表现出更高的刺激能力。BBR-CTA-Mic增强的基因激活作用可能归因于药物肝沉积的改善。

图7 | 体外药理作用

6.BBR-CTA-Mics增强体内能量相关基因的表达

基于BBR-CTA-Mic在体外显著的基因刺激能力，进一步在BBR制剂处理的HFD喂养的小鼠肝脏组织中评估其基因刺激效果。如图8 a所示，与未处理的模型对照（MC）或用空胶束处理（EM）的小鼠相比，BBR-CTA-Mic处理（BM）的小鼠肝脏中LDLR，p-AMPK和InsR基因的表达显著升高。通过RT-PCR证实了InsR、AMPK和AKT基因的增加（图8 b）；并且通过WB证实了LDLR、InsR、p-InsR、p-AMPK和p-AKT蛋白增加（图8 c）；p-AMPK/AMPK、p-InsR/InsR以及p-AKT/AKT的比率也显著增加。在BBR处理的（BS）小鼠中也观察到基因激活效应，但幅度低于BM处理的小鼠。在EM小鼠中未检测到刺激作用。这些结果表明，低BBR剂量的BBR-CTA-Mic可以有效诱导体内能量调节中枢基因的表达。事实上，BBR-CTA-Mic的基因调控作用呈剂量依赖性。

图8 | 体内药效学

7.BBR-CTA-Mics降低高脂喂养小鼠的血脂和葡萄糖水平

如图9 a所示，正常饲料组（NC组）小鼠血浆甘油三酯（TG）、胆固醇和LDL-c以及肝脏TG水平分别为0.54±0.11 mmolL-1、3.43±0.28 mmolL-1、0.40±0.10 mmolL-1和3.32±0.63 mgg-1；与NC组相比，HFD喂养导致这些数据显著升高（P<0.001）。与未治疗的MC组相比，BBR-CTA-Mic治疗显著降低了这些水平。在BS处理的小鼠中也观察到了降脂作用，但幅度低于BM处理的小鼠。对于这些脂质指标，在用空胶束处理的小鼠中没有发现显著变化（P>0.05）。此外，观察到对血糖水平也有类似的调节作用。本研究证明，低剂量的BBR（50 mg kg-1day-1）通过纳米载体促进肝脏BBR累计可以达到显著的降脂效果。

图9 | 体内高脂血症、体重和肥胖分析

8.BBR-CTA-Mics降低高脂喂养小鼠的体重增加和肥胖

肥胖是心血管疾病的高危因素，有研究认为BBR具有改善能量代谢和抑制脂肪生成的抗肥胖作用。在这项研究中，无论是否接受药物治疗，HFD喂养的小鼠的体重都被测量了16周。在实验结束时取肝脏、肠系膜和附睾脂肪并称重。如图9 b所示，与NC组相比，MC组小鼠表现出显著的体重增加。与未治疗或用EM治疗的小鼠相比，用BBR-CTA-Mic干预8周显著逆转了HFD喂养小鼠体重增加。结果表明，BM组小鼠的体重与NC组相似。与NC小鼠相比，MC小鼠的肝脏、肠系膜和附睾脂肪的重量显著升高。用药8周后，BBR-CTA-Mic治疗显著抑制了HFD喂养小鼠的肥胖，而BS治疗则显示轻微缓解（P>0.05）。EM治疗对HFD喂养的小鼠的体重或肥胖没有影响。此外，与NC小鼠相比，MC组的脂肪细胞大小显著增加。BBR-CTA-Mic药物使脂肪细胞大小恢复到NC小鼠的大小。BS小鼠的脂肪细胞小于MC小鼠，但差异不显著（P>0.05）。相比之下，肾脏、脾脏、心脏和肺的组织重量不受HFD的影响。该研究证明BBR-CTA-Mic（50 mg kg-1day-1）干预可以成功缓解HFD诱导的小鼠体重增加和肥胖。

9.BBR-CTA-Mics减轻高脂喂养小鼠的脂肪

如图10a所示，NC组肝脏显微照片表明肝脏结构正常，细胞质保存完好，细胞核突出。然而，通过油红O染色结果证明，在MC小鼠的肝脏中出现大量脂肪滴的球形空泡（图10 b）。BBR-CTA-Mic干预显著减少了肝细胞空泡和脂滴，与不给予或EM治疗相比，HFD喂养小鼠的血浆ALT水平降低。BS组小鼠肝细胞体积、脂滴蓄积和ALT水平较BM组小鼠略有下降，但幅度低于BM组。与MC组相比，EM组未发现显著变化。在这项研究中，作者证明了BBR-CTA-Mic（50 mg kg-1day-1）可以逆转HFD引起的肝脏脂肪积累和肝损伤。

图10 | 脂肪肝与肝损伤评价

10.BBR-CTA-Mics改善高脂喂养小鼠的炎症状态

研究表明慢性炎症与CMD的发生和发展有关。因此，促炎细胞因子已成为心血管疾病的治疗靶点。本研究对BBR制剂的抗炎作用进行了探究。检测了血浆样本中10种促炎因子：TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2、IL10、IL-12和IL-17、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、MMP-9和干扰素γ（IFNγ）。如图11 a所示，与NC小鼠相比，在MC小鼠中检测到TNF-α、IL-1β、IFNγ和IL-6的产生显著增加。用BBR-CTA-Mic治疗HFD喂养的小鼠极大地抑制了这些升高。进一步评估IL-6和TNF-α在肝脏和脂肪组织中表达的。如图11 b、c所示，MC小鼠肝脏和脂肪组织中IL-6和TNF-α水平显著上调，BBR-CTA-Mic处理后表达下调。值得注意的是，BM处理小鼠的IL-6和TNF-α水平几乎恢复到与NC小鼠相当的水平。通过RT-PCR和WB分析IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白质水平（图11d，e）。与免疫荧光结果一致，MC小鼠肝脏和脂肪组织中两种细胞因子的水平均显著高于NC小鼠。用BBR-CTA-Mic处理后，IL-6和TNF-α的水平显著降低，而BBR-S或载体的降低程度不那么显著。该研究表明BBR-CTA-Mic（50 mg kg^-1day^-1）具有有效的抗炎作用。

图11 | 炎症状态分析

11.BBR-CTA-Mics改善高脂喂养小鼠的动脉粥样硬化

检测到整个主动脉内的动脉粥样硬化形成。在所有组中记录主动脉弓和分叉血管的代表性油红染色图像。如图12所示，NC小鼠的主动脉几乎没有脂肪条纹，而HFD喂养增加了病变面积并诱导了脂肪条纹的增加。BBR-CTA-Mic治疗减少了这些病变的发展。结果表明，BBR-CTA-Mic干预（50 mg kg-1day-1）可以改善HFD诱导的代谢紊乱，使动脉粥样硬化的改善。

图12 | 动脉粥样硬化病变的评估

12.BBR-CTA-Mics的体内安全性

经过了4个月的安全性研究，来检查所有组的生物相容性。如图13所示，在治疗和未治疗的小鼠之间没有发现主要器官的明显组织学差异。治疗组与未治疗对照组的血浆ALT、AST、肌酐（CRE）和血尿素氮（BUN）水平未检测到显著差异，表明本研究设计的递送系统具有良好的组织相容性。

图13 | 体内安全分析

结果表明，BBR-CTA-Mic可有效促进肝脏沉积和肝细胞摄取BBR。体内研究表明，BBR-CTA-Mic（50 mg kg-1day-1）干预8周可显著增加肝脏中几种能量相关基因的表达，降低血浆中的脂质和促炎细胞因子，从而改善高脂饮食小鼠的代谢紊乱和动脉粥样硬化。综上所述，BBR-CTA-Mic可能是一种很有前景的治疗CMD的药物体系。

通过AFADESI-MSI空间代谢组学、Western Blotting、RT-PCR、HE染色、免疫荧光和Flow cytometry等技术，研究BBR-CTA-Mic对高脂饮食小鼠的代谢紊乱和动脉粥样硬化治疗效果，发现BBR-CTA-Mic不仅可有效促进肝脏沉积和肝细胞摄取BBR，还能降低血浆中的脂质和促炎细胞因子。本研究为CMD治疗提供新的药物选择。

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