肺炎支原体（MP）是引起儿童及成人呼吸道感染的重要病原菌，每年约10%-30%的社区获得性肺炎病例由其感染引起。大环内酯类抗生素（ML）是临床MP感染治疗的一线药物，2000年以后，国际上ML耐药MP比例持续升高，中国MP的ML耐药率一直居高不下。研究表明，MP的ML耐药与其23SrRNA基因突变 密切相关，其中2063、2064突变与ML高水平耐药相关，2617突变与低水平耐药相关^[1]。因此，上述位点的基因检测成为可替代ML体外药敏实验，快速检测MP的ML耐药的技术。目前耐药基因检测常用的方法有荧光PCR的高分辨率熔解曲线（HRMA）法、限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) 法、焦磷酸测序法等。 

基因分型是MP分子生物学与流行病学特征研究的重要手段。MP基因组高度保守，菌株间相似度高达99%，按照单核苷酸多态性（SNPs）和基因插入缺失，肺炎支原体可以分为两种基因型，基因型1和基因型2。目前针对这2种基因型常用的分型技术是PCR-RFLP分型技术^[2]和RT-PCR技术^[3]，前者基于肺炎支原体的p1基因和p1基因的VNTR，后者基于MPN459/MPNA5864基因。这两种分型技术，尽管操作相对简便，但是单个靶位点会带来MP分型效果不佳的问题。多位点的MLVA^[4]及MLST^[5]分型技术相继报道，有效提升了MP分型能力。然而，上述基因分型技术耗时且技术要求高，其应用受到限制，如果再加上MP耐药基因检测，那么检测流程会变得更加复杂。因此有必要开发一种快速、低成本的方法。本研究开发了一种基于多重PCR和MALDI-TOF MS同时检测MP多位点分型和ML耐药基因的方法。

本研究开发了一种基于多重PCR和MALDI-TOF MS方法同时检测MP的分型靶位点和ML耐药基因(表1)。该方法对 MP菌株核酸样本均可检测到明显的质量探针延伸峰(图 2)，同时检测20种非MP菌株核酸样本，均未检测到延伸峰，该方法具有良好的特异性；肺炎支原体M129菌株用于方法检出限测定，该方法最低检出限为100拷贝/反应；使用141株临床MP菌株的核酸样本进行分型与耐药分析，QuanNUA核酸分型质谱的检测结果与测 序和药敏结果一致率100%，该方法具有很好的鉴定准确性；在30例MP阳性临床样本中，25例中检测到9个分型与耐药SNP位点，检测阳性率为83.3%，该方法适用于MP类生长缓慢病原体的快速分型与耐药检测。

表1 用于肺炎支原体分型与耐药检测靶点的质量探针（点击查看大图）

图2 肺炎支原体分型与耐药检测所用质量探针延伸前(A)和延伸后(B)的质谱图

基于QuanNUA核酸分型质谱开发的同时检测MP多位点分型以及ML耐药基因方法，充分利用核酸质谱技术的多位点检测优势，准确性高，分型效果好且兼顾两种基因型菌株，与耐药相关的3个基因位点全部纳入方法中，实现分型与耐药的同时检测；而且，该方法可实现样本的高通量快速检测，检测周期短，从PCR扩增到质谱检测，6h内可完成96份样本的检测；同时，与现有检测方法相比，该方法检测成本较低，在临床样本的高通量检测中具有明显的优势。