应用上新丨基于MALDI-TOF MS的十种鸭病毒同时检测

2021-08-06 00:30:27, 中国农业大学融智生物科技（青岛）有限公司

背景

自20世纪90年代中期以来，我国水禽养殖业快速发展，养鸭业目前已成为我国农村养殖业的支柱产业之一，新发传染病不断出现，使水禽疾病防控形势日趋严峻。

图片来源自网络

仪器与试剂

目标鸭源性病原体包括DHAV-1分离株C80（DQ864514）、DHAV-3分离株C-GY（EU352805）、DAstV-1 分离株D17（MN149392）、DAstV-2 分离株SL4（KF753806）、DRV-1分离株815-12（KC508656）、DRV-2 分离株091（JX478256）、TMUV分离物PS（KT876991）、GPV分离物JS1（KT935531）和DEV来自中国农业大学兽医学院。AIV 亚型H9N2（GQ373128）由中国农业大学禽流感实验室提供。所有这些病毒在检测前均经RT-PCR/PCR鉴定。非靶标鸭源性病原菌包括大肠杆菌、沙门氏菌和鸭疫里默氏菌，均来自中国农业大学兽医学院。2.5×PCR mix、质量探针试剂盒，以及QuanTOF质谱仪及QuanNUA软件，均来自于融智生物科技（青岛）有限公司。

QuanNUA核酸质谱系统

实验方法

分别下载10种病毒的基因组序列，针对选定的靶基因，设计质粒构建用引物和检测用引物，分别构建了标准质粒，建立检测方法，并确定检测方法的特异性；对标准质粒进行10倍系列稀释，确定该方法的敏感性。利用该检测方法对人工制备的混合感染样品进行检测，与普通 PCR 检测结果进行比对。

小tips

核酸质谱方法优势：核酸质谱具有高通量的优势，非常适用于多重病毒联合检测

结果与讨论

结果显示，本研究所建立的检测方法可同时检测到包括鸭甲肝病毒 1 型、鸭甲肝病毒 3 型、鸭星状病毒 1 型、鸭星状病毒 2 型、鸭呼肠孤病毒1型、鸭呼肠孤病毒2型、坦布苏病毒、禽流感病毒、小鹅瘟病毒和鸭病毒性肠炎病毒等10种病毒和1种内参基因，且10种病毒之间的检测结果互不干扰；对10倍系列稀释的标准质粒进行检测，当稀释度为10-10时仍能检测到核酸，针对不同病毒的标准质粒最低检出量为1.3~7.8 × 100 copies，对混合样品的检测结果与普通 PCR 结果一致。

(a) DRV-1 and DRV-2

(b) DHAV-1, DHAV-3, DAstV-1, and DAstV-2

(d) DHAV-1, DHAV-3, DAstV-1, DAstV-2, DRV-1, DRV-2, TMUV, AIV, GPV, and DEV

研究人员用已知含有特定病毒的临床样品模拟了四种混合感染，对该方法进行了评价。如预期的那样，在所有的样本中，都能准确地识别出目的病毒，包括RNA和DNA病毒。

结论

综上所述，本研究建立的基于QuanNUA核酸分型质谱的10种鸭源性致病病毒的快速检测，方法特异性良好，与普通PCR相比，基于QuanNUA核酸分型质谱的检测方法的灵敏度大大提高，并可对同一样品进行多种病毒的检测，使整体检测成本下降，不同病毒之间的检测结果互不干扰，可为鸭病毒病病原的快速诊断和分子流行病毒学调查提供极大便利。基于核酸质谱的检测方法，可实现对无法以核糖体蛋白作为生物标志物的微生物进行检测，使MALDI-TOF MS有望成为对此类微生物进行快速、高灵敏分型鉴定的新的有效工具，具有一定的应用推广潜力。

参考文献

Establishment of a simultaneous detection method for ten duck viruses using MALDI-TOF mass spectrometry. Ning Liua,Lei Wanga,Gaozhe Caib,et al. [J].Journal of Virological Methods, 273 (2019) 113723.

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