Cell | 肠道关注：一篇整合了肠道微生物组、代谢组、宿主表观基因组和转录组的纵向多组学研究

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2020年9月，美国梅奥诊所消化内科和肝病科Purna C. Kashyap研究团队和明尼苏达大学生物科学学院Dan Knights团队合作在Cell期刊上发表了题为“Longitudinal Multi-omics Reveals Subset-Specific Mechanisms Underlying Irritable Bowel Syndrome”的研究成果，通过肠道微生物组、代谢组、宿主表观基因组和转录组多组学整合研究方法，发现了深入探究了肠易激综合征宿主-微生物相互作用机理，为慢性胃肠道疾病综合治疗新靶点的发现提供了理论依据。

肠易激综合症（IBS）是一种普遍存在的疾病，基于便秘形式分为三类，便秘为主（IBS-C），腹泻为主（IBS-D）或混合型（IBS-M）。IBS发病机制涉及胃肠动力、肠分泌物、内脏超敏反应和肠通透性变化，可通过肠道微生物组改变。此外IBS症状会受到饮食、宿主遗传学和环境的影响，这些因素也可以调节人类肠道微生物组。通过移植实验发现肠道微生物组在IBS中发挥作用，包括转运时间、疼痛感阈值和肠道通透性。但是在缺乏IBS动物模型的情况下，需要进行人类研究才能揭示肠道微生物组与相关人类特异性疾病途径的相互作用。IBS的人体研究受到横截面采样和亚型分层的限制，导致对微生物组的研究缺乏一致性。另外IBS以症状缓解和恶化的时期为特征，横截面样本不能解释疾病的时间变异性。最后人与动物宿主生理的内在差异也导致对IBS肠道微生物组作用障碍理解的偏差。

针对上述问题，作者针对IBS患者亚组进行了一项研究，整合微生物基因组、宿主转录组和甲基化组等多组学测量结果，评估了宿主功能和微生物代谢改变驱动的IBS亚型特异性机制，以及同时发生的宿主生理变化。

1.样本准备

微生物组和宿主样品采用纵向多组学采样方法，确定驱动IBS中亚型特异性表型的微生物介质。77名参与者均提供粪便样本，其中42名接受肠镜检查，获得结肠活检样本。12名受试者额外提供了健康状态下的粪便样本（IBS-C和IBS-D各6名）。

2.多组学实验

（1）粪便微生物组：DNA测序和比对、16S rRNA 测序

（2）转录组学：甲基化基因测序分析

（3）代谢组学：血清和粪便样品（1H NMR非靶代谢组分析）；胆汁酸LC-MS / MS靶向代谢组；短链脂肪酸GC-MS / MS靶向代谢组；色氨酸LC-MS / MS靶向代谢组

3.其他检测

（1）结肠黏膜分泌反应

（2）定量分析细胞因子：IL-8, IFNg, IL-10, Il-18, IL-22, Leptin, VEGF, MIG, IL-1b, IL-17A, IL-1RA, IL-6 & TNFa.

（3）体外和体内次黄嘌呤的消耗实验

1.纵向采样克服了跨部门微生物组研究中的异质性

在慢性疾病中进行纵向采样的方式能可靠地识别使用横截面采样方式遗漏的微生物群变化。基于Bray-Curtis b多样性的PCoA分析表明，IBS中的粪便微生物群按亚型聚集，IBS-D和IBS-C与HC样品以及彼此之间显示出的分散性显著不同（图1D和1E）。IBS-C样本比IBS-D分布更不规则。

2.纵向采样揭示了随着时间的流逝，IBS-C微生物群具有更大的可变性

与HC和IBS-D受试者相比，IBS-C患者的粪便微生物群组成随时间表现出更大的变异性（图1G）。作者测试了肠道管腔和粘膜相关菌群的差异，这些差异与IBS有相关性，结果发现粪便样品中结肠黏膜与管腔微生物群组成有显著差异（图1H）。与HC相比，IBS患者粘膜相关菌群的特征是变形杆菌水平较高（图S1G）。与IBS-D或HC相比，IBS-C患者的黏膜相关微生物群与其各自的腔内微生物群相似性较低（图1I）此外IBS-C患者的粘膜相关菌群的个体内变异性随时间变化更大，与腔内菌群变化相似（图1J）。

图1 | IBS-C患者的肠道菌群组成更加明显且易变

3.IBS症状严重程度与肠道菌群功能变化有关

重度IBS-D与轻度中度IBS-D相比，超过20个乳酸杆菌属的相对丰度较高，但与受试者食用益生菌或乳制品无关。从粪便宏基因组学数据中发现，74个KO术语与严重的IBS-C相关，而44个KO术语与严重的IBS-D相关。与轻度/中度IBS患者相比，重度IBS-C和IBS-D中发现了与双歧杆菌和链球菌呈正相关的醇脱氢酶（ADH）。腹痛是IBS-C和IBS-D共同的主要症状，表明ADH活性可能与腹痛有关。此外作者发现按照布里斯托大便分类法记录的粪便形式和排便前的腹痛与特定细菌和代谢产物有关。

4.与生理学测量相结合的代谢组学，为研究肠道微生物群代谢对胃肠功能的影响提供了深入见解

为更好地了解肠道菌群驱动的症状病理机制，定量分析与管腔和粘膜生化特征相关的微生物组产生的代谢物。与HC相比，IBS-C患者粪便样本中的短链脂肪酸（SCFA）丙酸酯、丁酸酯和乙酸酯显著降低（图2A），该结果与腔内代谢产物规律一致。与HC组相比，IBS-C组的结肠黏膜活检样品中的乙酸盐（GC-MS代谢组学方法测定）也显著降低。实验结果表明，SCFA的差异与膳食纤维的总摄入量无关。为确定IBS-C患者粪便和活检组织中SCFA的生理较低的相关性，作者检测了血清素（5-HT），发现BS-C患者对结肠活检分泌的5-HT显著低于HC（图2C），与IBS-C患者的粪便形式一致。

有研究表明，细菌产生的单胺类色胺可激活5-羟色胺受体4（5-HT4R）可导致小鼠液体分泌增加和运输时间缩短，但尚未确定在人类疾病中的生理作用。因此作者使用靶向代谢组方法（LC-MS）研究了粪便样品中色胺和其他色氨酸代谢物的变化，发现IBS-D患者粪便样本中的色氨酸和色胺都显著增加（图2D），可部分归因于IBS-D粪便中水分增加，经过验证这些代谢物的变化与蛋白质摄入差异无关。相关实验也表明色胺可引起IBS患者和HC组的结肠上皮液体分泌。

胆汁酸（BAs）胆酸（CA）和鹅去氧胆酸（CDCA）可通过微生物胆汁盐水解酶（BSHs）从其甘氨酸或牛磺酸结合物中解离，并成为各种微生物修饰的底物。因此作者检测了IBS组中BAs的微生物转化是否存在差异，有利于改变肠道分泌物。LC-MS/MS的靶向结果表明，与HC相比，IBS-D患者粪便样品中未结合的初级BA含量显著较高，IBS-C相对较低（图2E）。与HC和IBS-C受试者相比，IBS-D中BA结合物的量更高。作者通过实验证明，CDCA可使肠道分泌的离子通量（Isc）显著增加，证实了CDCA升高对IBS-D患者粪便中水含量增加的生理作用。

为确定色胺和主要BA含量差异与生理的相关性，作者测量了三组结肠活检组织Isc的差异，发现IBS-D患者的结肠活检组织的Isc基线水平更高（图2F），与色胺和原发性BA的分泌作用相一致。

图2 | 代谢组学与生理学测量相结合，为了解肠道菌群代谢对胃肠功能的影响提供了深入见解

5.微生物组-代谢组学整合分析确定了IBS中的新型微生物代谢途径

采用了非靶向代谢组学方法来鉴定可能导致IBS病理生理变化的新型微生物途径。通过基于非靶向1H-NMR光谱代谢数据的PLS-DA模型可确定IBS亚组和HC粪便样品之间的代谢变化。与HC相比，IBS-C患者粪便样品中的赖氨酸、尿嘧啶和次黄嘌呤均显著降低（图3A-3C）。IBS-D患者的次黄嘌呤也较低。为了深入了解微生物对粪便次黄嘌呤的贡献，通过宏基因组学发现IBS-C中的黄嘌呤脱氢酶/氧化酶和黄嘌呤磷酸核糖基转移酶模块相对于HC有所升高（图3D），也发现IBS-C肠道微生物组应对氧化应激的能力增强。表明IBS患者的微生物组对次黄嘌呤的利用和分解能力增强，与IBS-C粪便中次黄嘌呤水平的降低一致。

6.微生物基因区域分析证实与胆汁酸、丁酸和次黄嘌呤代谢的相关性

为进一步阐明微生物对IBS中鉴定出的差异代谢物丰度的贡献，使用将结构可变的基因组区域与代谢物丰度相关联的方法（SV关联）测试了可能导致个组代谢水平差异的特定细菌基因组区域，通过鉴定微生物群的缺失区（DR）或丰度可变的可变区（VR）鉴定参与代谢产物生产或消耗的微生物基因，结果确定了分别与9种和8种代谢物相关的16种DR区和20种VR区。

鹅去氧胆酸（CDCA）是最常见的代谢产物，与4个DR和7个VR相关。胆酸（CA）和3个DR和7个VR相关。微生物基因组区域与胆汁酸的多种关联可反映涉及初级BA修饰的未知基因。BS-C样品中存在两个来自黑麦芽孢杆菌区域，其表达水平显著降低，且与丁酸正相关。次黄嘌呤与名为Lachnospiraceae sp的VR区域关联最强（图4A和4B），表明次黄嘌呤用于生长的可能性增加。

图4（AB） | 微生物基因区域表现的特定肠道微生物组的次黄嘌呤消耗量

7.微生物代谢促进了次黄嘌呤水平变化

使用LC-MS靶向代谢组方法发现，与长双歧杆菌相比，来自2个Lachnospiracea菌株和H. hathewayi菌株的生长培养基中次黄嘌呤水平显著降低（图4C）。同时发现与移植双歧杆菌的小鼠相比，Lachnospiraceae sp的小鼠的盲肠内次黄嘌呤水平明显降低。表明次黄嘌呤水平是微生物生产与消费之间平衡的结果。

图4(C-E) | 微生物基因区域表现的特定肠道微生物组的次黄嘌呤消耗量

8.IBS患者发病时肠道微生物组和微生物代谢产物的改变

将IBS患者作为一组时，特定细菌类群与IBS-D和IBS-C患者显著相关。IBS-C和IBS-D患者的平均样本中原发性胆汁酸（BA）显著升高（图5E和5F）。在IBS-D中发现醇脱氢酶丰度，与TCA和呼吸作用的增加相吻合。

IBS异质性说明个别患者的症状可能存在明显的变化。在IBS患者亚群中，包括色胺、CA和CDCA等代谢产物升高。独特的微生物和代谢特征可能是不同患者症状恶化的基础。

图5 | IBS患者发病时肠道微生物组和微生物代谢产物的改变

9.微生物组和代谢组学与转录组学和表观遗传学差异相结合揭示IBS中新型的宿主-微生物组相互作用

IBS的病理生理是多因素的，来自宿主途径、微生物途径和宿主-微生物共代谢。为了确定微生物代谢对宿主功能的影响，首先比较结肠活检组织中观察到的转录和表观遗传变化，通过整合转录组数据与代谢物和微生物群落丰度的交叉组学相关网络，鉴定了宿主-微生物-代谢物之间的相互作用。比较IBS-C和HC或IBS-D和HC时，分别鉴定出82个和78个差异表达基因。KEGG途径富集分析显示，IBS患者与免疫和炎症相关。

表观基因组分析专注于表征差异甲基化区域（DMR）。对DMR基因的KEGG途径富集分析表明，两种IBS亚型均富集了抗原加工和呈递途径。这种富集归因于人类白细胞抗原（HLA）II类基因，这种基因被发现与腹腔疾病相关，可以预测IBS患者对无麸质饮食的反应。

基于机器学习的整合方法，形成基因转录物和基因代谢物关联网络（图6）。在网络中，在乙酸盐和PGLYRP1和KIFC3基因存在一个枢纽（图6B），表明其相关性，乙酸盐是一种代谢产物，在IBS-C的粪便和活检样品中丰度较低。

图6 | 基于Lasso Penalized回归方法的多组学集成结果

10.多组学整合表明结肠上皮中的嘌呤缺乏是IBS潜在的新机制

IBS-C和IBS-D粪便中次黄嘌呤含量显著降低，表明微生物次黄嘌呤的降解导致肠道次黄嘌呤水平降低，并确定产生功能性变化，表明微生物组在IBS-C粪便中增加嘌呤降解（图3和7）。然而由于次黄嘌呤是宿主-微生物共代谢物，因此可能同时受到微生物和宿主代谢的影响。为确定宿主对次黄嘌呤减少的反应，检测了结肠活检组织中嘌呤代谢基因表达的变化。与HC相比，两种IBS亚型的结肠活检中人黄嘌呤氧化酶的基因表达均升高，表明次黄嘌呤的消耗可能是微生物组和宿主共同结果。为了确定次黄嘌呤耗尽对宿主的继发作用，检测了嘌呤挽救途径中可能的转录变化。嘌呤挽救途径中的第一个基因嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）在IBS-C和IBS-D中表达均提高2倍（图7A），在IBS患者中，PNP表达与IBS的次黄嘌呤水平呈负相关（图7D）。总之，微生物群和宿主对嘌呤核苷酸的降解增加，在结肠组织中引起代谢应激，也可能会通过增加嘌呤挽救而导致代偿性反应。基于多组学的结果，作者认为低水平的嘌呤核苷酸可能导致较低的上皮能量状态和粘膜修复能力，可能是IBS的病理生理学基础之一。

图7 | IBS的多组学综合结果指明嘌呤挽救途径中的微生物组-宿主相互作用

IBS-D患者结肠分泌增加，表明上皮运输的固有变化或分泌的代谢产物增加。观察到的促分泌素（例如主要的BA、CDCA和细菌代谢物类胰蛋白酶）增加表明，较高水平的微生物群分泌化合物可能促使IBS-D分泌增加。

通过整合多个宿主和微生物组数据，作者确定了嘌呤代谢的宿主-微生物途径，该发现可能在IBS的病理生理中起重要作用。这是次黄嘌呤首次涉及IBS发病机制，表明多组学整合方法可确定基于基因表达的人类特异性反应的潜在疾病机制及相关性。次黄嘌呤相关酶也成为有潜力的药物靶标点。

本研究也提供了其他新的治疗靶点。例如，可以使用将CDCA转化为LCA的高能力微生物群落来治疗IBS-D患者中BA的减少。在IBS-C患者中，增加微生物中的SCFA和/或色胺可能是可行的治疗策略。总之，本文采用的综合纵向多组学研究加强乐宿主和微生物疾病的认识，从而确定改善治疗的目标。

本文作者整合了肠道微生物组、代谢组、宿主表观基因组和转录组的纵向多组学数据，以肠易激综合征（IBS）宿主生理为背景，确定了IBS亚型特异性和症状相关的微生物组成和功能变异特征。部分发生变化的微生物代谢产物对应于与IBS相关的宿主生理机制。通过整合多组学数据，确定嘌呤代谢是IBS的一种新型宿主-微生物代谢途径。

肠道微生物组与多种人类慢性胃肠道（GI）疾病有关。由于动物和人类研究的脱节以及缺乏针对疾病特定生理变化综合研究，因此很难确定其在疾病中的作用机理。本研究通过多组学技术及多种数据整合方法，不仅深入研究了宿主-微生物的相互作用机制，也为慢性胃肠道疾病综合治疗策略的治疗靶点提供新的研究策略，值得深入学习和借鉴。

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嫣然 撰文

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