项目文章 | 上海市胸科医院孙加源团队揭示肺腺癌中铁死亡敏感性的机制

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2021年3月，欧易/鹿明生物客户上海市胸科医院孙加源教授课题组在Theranostics期刊上发表了题为“Endogenous glutamate determines ferroptosis sensitivity via ADCY10-dependent YAP suppression in lung adenocarcinoma”的研究成果，通过蛋白质组学技术研究方法，发现了内源性谷氨酸对LUAD细胞XC-系统抑制后铁死亡的敏感性至关重要，揭示了相关机制，为基于铁死亡的肿瘤治疗新方法提供了理论依据。

2012年Dixon等人首次描述了铁死亡（Ferroptosis），这是一种与细胞凋亡和坏死不同的新型细胞程序性死亡方式。铁死亡的特征是通过铁依赖性机制对磷脂进行了过度的氧化修饰。许多方法通过抑制Xc-系统引发铁死亡[1]。索拉非尼，erastin及其衍生物是铁死亡激活剂，这些分子阻止胱氨酸进入细胞，从而减少谷胱甘肽（GSH）的产生。而抑制摄取胱氨酸的同时会降低内源性谷氨酸外排[2]。迄今为止，许多研究已经报道了胱氨酸的关键作用，但是对于内源性谷氨酸积累后的结果知之甚少。

肺腺癌（LUAD）是常见的恶性肿瘤，手术切除是早期LUAD最有效的治疗方法，而晚期患者可从辅助细胞毒性疗法中受益。但是耐药性通常是LUAD复发的主要原因。最近有研究报道对顺铂耐药的肿瘤细胞对铁死亡很敏感[3]。但是不同的LUAD细胞对铁死亡的敏感性不同，其潜在机制仍不清楚。

1.YAP被抑制的程度对LUAD细胞的铁死亡敏感性至关重要

作者首先研究LUAD细胞是否比肺成纤维细胞对铁死亡更敏感。与LUAD细胞相比，肺成纤维细胞中的不稳定铁，AA和AdA含量较低，从而导致了对erastin诱导的铁死亡的抵抗力。然而，尽管细胞活力降低（图1A）、诱导细胞死亡（图1B-C）、线粒体膜密度浓缩（图1D）、脂质ROS和MDA生成（图1E-F）以及不稳定铁升高（图1G）的程度不同，LUAD细胞对erastin敏感。由于亲脂自由基清除剂Fer-1和氧化还原非活性铁螯合剂DFO可以逆转erastin诱导的效应（图1A-C，E-F），因此它们与铁死亡有关。这些结果表明，LUAD细胞中可以诱导铁死亡，但铁死亡敏感性不同。

为了研究LUAD细胞对铁死亡敏感性的机制，作者分析了用erastin处理前后的细胞系蛋白质组。由于H1975和A549细胞分别显示出对erastin最高和最低的敏感性（图1A-G），因此作者比较了两种细胞各自蛋白质组学结果里差异最大的5个上调蛋白和5个下调蛋白的变化（图1H-I）。A549细胞所有10种蛋白质的变化方向都与H1975细胞中的相同。

与erastin相似，索拉非尼也是XC-系统的抑制剂，并具有诱导铁死亡和降低LUAD细胞中YAP水平的能力（图1J）。但是，另一种针对谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的铁死亡刺激物RSL3，在LUAD细胞中未能诱导铁死亡或降低YAP水平，表明LUAP细胞中YAP是在XC-系统受到抑制后特异性受到的抑制。随后作者调查了YAP的抑制程度是否对铁死亡敏感性至关重要。诱导的细胞死亡程度与LUAD细胞中剩余的YAP水平呈负相关（图1J-K）。βTrCP缺失阻止erastin对YAP的抑制作用，导致铁死亡和MDA降低，这在LUAD细胞中几乎处于同一水平（图1L-M），表明铁死亡的敏感性降低了。

图1 | 抑制YAP的水平有助于LUAD细胞中的铁死亡敏感性

2.LUAD细胞的铁死亡敏感性是由内源性谷氨酸依赖性抑制YAP O-GlcNAcylation决定的

为了探讨内源性谷氨酸的积累是否有助于抑制LUAD细胞中的YAP，作者试图消除LUAD细胞中的内源性谷氨酸。摄取、脱氨基和转氨基的一套机制维持着谷氨酸稳态（如图2A所示）。当同时敲低GLAST和GLT1时，内源性谷氨酸含量会降低到非常低的水平。由于谷氨酸对肿瘤细胞具有重要的生理意义，因此作者构建了基于LUAD细胞的Dox诱导的GGG细胞，同时实现GLUD1过表达、GLAST和GLT1敲低（图2B）。为了在Dox诱导的GGG细胞中重建细胞内谷氨酸，作者使用抑制剂EGCG抑制GLUD1成功地将细胞内谷氨酸逆转到基础水平（图2C）。内源性谷氨酸耗竭后，铁死亡敏感性和MDA的变化受到抑制，并通过EGCG恢复（图2D-E）。这些结果与阻断erastin抑制YAP时的结果相似（图1J-K），表明YAP抑制是内源性谷氨酸积累的结果。

随后作者研究了内源性谷氨酸积累如何抑制YAP。作者推测内源性谷氨酸积累通过抑制YAP的O-GlcNAcylation来抑制YAP。用erastin处理后，O-YAP^T241和总YAP均显著降低，并且这些效应在谷氨酸消耗后减弱。相反，Hippo通路靶向的主要磷酸化位点p-YAP^S127在H1975细胞中以谷氨酸依赖的方式被erastin增加（图2F）。丙氨酸替换Thr241阻断了erastin诱导的和谷氨酸依赖的YAP O-GlcNAcylation抑制（图2G），表明Thr241是XC-系统抑制后主要受影响的O-GlcNAcylation位点。值得注意的是，内源性谷氨酸缺失使LUAD细胞对O-YAP^T241和总YAP的erastin抑制脱敏（图2H-I）。p-YAP^S127的升高也有类似的作用（图2J）。这些结果表明，减少O-GlcNAcylation是内源性谷氨酸诱导的YAP抑制的先决条件。然而，谷氨酸依赖的YAP抑制并没有被Fer-1挽救（图2F），表明这种抑制不是产生脂质ROS的影响。在YAP-/-H1975细胞中重组WT-或T241A-YAP后，发现引入T241A突变使H1975细胞对erastin处理不敏感（图2K-L），表明Thr241处YAP的O-GlcNAcylation是增加铁死亡敏感性的靶点。

图2 |  内源性谷氨酸的积累通过降低YAP O-GlcNAcylation来决定铁死亡的敏感性

3.GFPT1介导谷氨酸诱导的YAP-O-GlcNAcylation抑制来调节铁死亡敏感性

接着作者探讨了内源性谷氨酸的积累抑制YAP O-GlcNAcylation的机制。O-GlcNAcylization的流入由HBP决定（图3A）。对属于HBP的代谢物进行测试，发现在H1975细胞中用erastin处理后，在从GlcN-6-P到UDP-GlcNAc的变化过程中产生的代谢物发生内源性谷氨酸依赖性减少（图3B）。这些代谢物位于GFPT1下游（图3A）。相反，仅观察到GFPT1上游代谢产物的轻微累积（图3B），这意味着GFPT1下游的代谢受到阻碍。与YAP O-GlcNAcylization和总YAP（图2H-I）类似，erastin抑制的GFPT1活性在LUAD细胞中也是谷氨酸依赖性的（图3C），因此作者假设谷氨酸依赖性抑制YAP和减少其O-GlcNAcylization是通过抑制Xc-系统后抑制GFPT1介导的。为了验证这个假设，作者通过补充下游代谢物来规避GFPT1的抑制作用，发现erastin诱导的P-YAP^S127，以及O-YAPT241和总YAP的减少因此而降低（图3D）。然而葡萄糖水平并不影响YAP（图3D）。

在遗传水平上，通过抗erastin的GFPT1^S205A重组GFPT1成功地恢复了GFPT1的活性和表达（图3G）。这种变化也阻止了H1975细胞中Xc-系统抑制后YAP的抑制和磷酸化（图3G）。半衰期实验发现GFPT1延长了H1975细胞中YAP的半衰期，表明GFPT1增强了YAP的蛋白质稳定性（图3H），并且这种效应可能是通过阻止βTrCP-YAP相互作用和减少YAP泛素化的结果（图3I）。总之，内源性谷氨酸对YAP的抑制及其O-GlcNAcylization是由GFPT1在抑制XC-系统后介导的。

图3 | GFPT1是内源性谷氨酸决定铁死亡敏感性的关键

4.无效的XBP1剪接促进LUAD细胞中谷氨酸依赖性GFPT1的抑制

接着作者探索了抑制LUAD细胞中的Xc-系统后增强抑制GFPT1的机制。GFPT1表达的下调与erastin处理后LUAD细胞中GFPT1活性的抑制相关（图3C和4A-B）。敲除GFPT1同时导致A549和H1975细胞中GFPT1活性降低（图4C），进一步支持GFPT1活性的抑制由于其表达量被抑制的观点。已知没有有效的XBP1剪接，GFPT1水平通常会迅速下降，因此作者检测了编码未拼接和拼接形式XBP1蛋白的XBP1u和XBP1s mRNA。发现与XBP1u mRNA相比，XBP1s mRNA在LUAD中缺失的频率更高（图4D-E）。为了进一步研究无效的XBP1剪接是否有助于erastin处理后抑制的GFPT1表达，作者在H1975细胞中补充XBP1，发现受损的GFPT1表达和活性减少（图4F）。相反，经erastin处理后，MDA-MB-231细胞中GFPT1的表达和活性不能在XBP1敲除后维持（图4G）。总的来说，这些结果意味着LUAD细胞中无效的XBP1剪接在抑制Xc-系统之后有助于GFPT1的抑制。

图4 | LUAD细胞中无效的XBP1剪接有助于谷氨酸对GFPT1的抑制

5.ADCY10是GFPT1的谷氨酸依赖性磷酸化的关键因子

虽然GFPT1可以在Ser205处磷酸化（图4F-H），但在抑制Xc-系统后如何通过谷氨酸发生该现象尚不清楚。由于p-GFPT1^S205受PKA调控，因此作者研究了PKA是否也参与了Xc-系统抑制后的这种磷酸化。用PKA抑制剂处理H1975细胞成功阻断了谷氨酸依赖性诱导的的p-GFPT1^S205（图5A）。YAP和GFPT1的表达和活性也以PKA依赖的方式受到抑制（图5A-B）。在PKAα-过表达的A549和H1975细胞中，铁死亡以及铁死亡相关的脂质ROS和MDA生成增强（图5C-F），表明GFPT1在抑制XC-系统后以谷氨酸依赖的方式被PKA磷酸化。

PKA接收来自cAMP的上游信号，其形成由ADCYs催化。因此作者研究了ADCY对GFPT1的PKA依赖性抑制的可能性。UALCAN数据库表明只有ADCY10在LUAD组织中上调（图5G），此外只有敲除ADCY10导致H1975细胞抵抗erastin抑制GFPT1的活性（图5F）。然后作者探讨了谷氨酸是如何刺激ADCY10的，发现在EGTA存在的情况下，谷氨酸依赖性增加的Ca²⁺和cAMP水平以及GFPT1活性的降低发生了减少（图5I-K），表明增加Ca²⁺是谷氨酸刺激ADCY10和依赖ADCY10的功能的关键。

作者发现erastin降低GFPT1活性和诱导cAMP浓度的程度与基础ADCY10水平显著相关（图5L-M）。随后对原代LUAD组织进行切片培养，以评估ADCY10在体外测定铁死亡敏感性中的作用，发现erastin倾向于在ADCY10高表达的LUADs样品中诱导铁死亡和MDA水平（图5N-O）。

图5 | ADCY10 PKA依赖地决定LUAD细胞中的铁死亡敏感性

6.由于ADCY10水平升高，铁死亡对晚期和耐药的LUAD是有益的

接着作者降低了LUAD细胞中ADCY10的表达，并进行了体外和体内功能实验，以探索ADCY10是否是原癌基因。敲除ADCY10导致CDX负荷小鼠的总生存期更长（图6B），但较高的ADCY10表达意味着人类LUAD患者的OS更差（图6C）。由于ADCY10的上调与人类LUADs中的肿瘤分期相关（图6D），作者建立了两个来自Ⅰ期（PLUADC-I）和Ⅲ期患者（PLUADC-III）的原代LUAD细胞系。与PLUADC-I细胞相比，ADCY10高表达的PLUADC-III细胞对erastin诱导的细胞活力降低和GFPT1和YAP的抑制更为敏感（图6E）。当erastin的浓度高达10%μM，并没有杀死支气管上皮BEAS-2B细胞或肺成纤维细胞MRC-5（图6F），表明基于铁死亡的治疗是治疗LUAD相对安全的策略。此外与PLUADC-I细胞相比，PLUADC-III细胞更具侵袭性，在肺中显示出更多的血管（图6I-K），并且这些作用在很大程度上受到IKE的抑制（图6L-N）。总的来说，铁死亡相关治疗是治疗ADCY10高表达的LUAD患者（如晚期患者）的一个很好的选择。

图6 | ADCY10高表达的LUADs易受铁死亡影响

7.YAP抑制依赖的不稳定铁升高后LUAD细胞对铁死亡的敏感性不同

YAP抑制调节铁死亡环境的下游机制尚不清楚。实验发现βTrCP缺失显著减少了erastin引起的不稳定铁的增加（图7A）。不稳定铁升高的趋势与YAP被抑制的趋势相反，这也是谷氨酸依赖性的（图2I和7B）。H1975细胞用erastin处理8小时后，观察到明显的YAP降低（图7C）。在erastin处理后10小时开始观察到LUAD细胞中不稳定铁的变化继发性增加（图7D）。在10小时时也观察到脂质ROS的产生（图7E），这可能是因为铁介导的Fenton反应增强了当时的脂质过氧化。在12小时检测到第二次增强的erastin诱导的细胞死亡和细胞活力降低（图7F）。为了进一步研究不同的铁死亡响应是否是不稳定铁二次升高后的结果，作者在erastin处理后10小时通过DFO阻断不稳定铁的升高（图7D）。结果发现铁死亡反应的变化减小（图7E-F）。这些结果表明，铁死亡的敏感性是由YAP抑制在后期提高LUAD细胞中各种次级不稳定铁来决定的。

图7（A-F） | 通过升高FTH1以降低YAP敏感的铁死亡

8.在Xc-系统抑制后，YAP抑制导致在后续阶段铁蛋白持续转录失败

蛋白质组学分析中发现铁代谢相关的蛋白如FTH1的丰度降低（图1G）。与YAP相似，erastin处理后剩余的FTH1水平与铁死亡的程度呈负相关（图7G），表明YAP抑制促进的铁死亡依赖于FTH1。当YAP抑制被阻断时，通过siRNA敲低FTH1可使βTrCP-/- H1975细胞对erastin诱导的铁死亡的反应重新敏感（图7H）。

接着作者研究了Xc-系统抑制后YAP调节FTH1的方式。即使谷氨酸被耗尽，在H1975细胞中用erastin处理后2小时之内外源性FTH1蛋白仍然被消除（图7I），表明铁蛋白吞噬以谷氨酸非依赖性的方式发生。但是内源性FTH1蛋白改变的趋势完全不同。由于铁蛋白吞噬作用，内源性FTH1在第1小时内下降（图7I）。过多的铁反馈会诱导FTH1基因转录，从而解释了为什么FTH1 mRNA表现出代偿性增加并且FTH1蛋白从第2小时到第8小时一直保持不变（图7I-J）。这些结果表明，抑制XC-系统后，FTH1在早期受到YAP的转录刺激，但在晚期不能持续。

NCOA4是一种运货受体（cargo receptor），在Xc-系统抑制后，通过铁蛋白吞噬作用参与FTH1降解。NCOA4缺失减少了H1975细胞中erastin诱导的YAP向FTH1启动子的募集（图7K），表明铁蛋白吞噬触发了FTH1的YAP依赖性转录补偿。最后作者研究了抑制Xc-系统后，YAP抑制在后期是否导致FAP1启动子与YAP分离。尽管在erastin处理后的最初4小时内，向FTH1启动子的YAP募集持续增加，但在以谷氨酸依赖性方式抑制YAP后，YAP募集开始减少（图7L）。此外，FTH1启动子上的TFCP2富集没有受到影响（图7M），表明YAP的作用是特异性的。总体而言，YAP抑制不能在转录后期维持铁蛋白。

图7(G-M) | 通过升高FTH1以降低YAP敏感的铁死亡

铁死亡是一种新的细胞程序性死亡方式，可由抑制胱氨酸-谷氨酸逆转运蛋白系统Xc-后诱导。然而内源性谷氨酸在肺腺癌（LUAD）中积累后的结局尚未确定。本文研究发现抑制Xc-系统后内源性谷氨酸的积累通过抑制YAP来决定LUAD细胞的铁死亡敏感性。LUAP细胞中的YAP的表达和O-GlcNAcylation在GFPT1受损后无法持续。ADCY10是下游关键的靶标，并且使谷氨酸对PKA依赖的GFPT1抑制作用多样化。此外还发现ADCY10分别介导了促癌和促铁死亡作用。具有高ADCY10表达的晚期LUAD患者对铁死亡敏感。且具有耐药性的LUAD细胞也倾向于ADCY10高表达，更可能响应于铁死亡。最后，由于在后期无法维持YAP刺激的铁蛋白转录补偿而引起的次级不稳定铁的增加程度有所不同，这进一步解释了为什么铁死亡敏感性在LUAD细胞之间会发生变化。内源性谷氨酸对LUAD细胞抑制XC-系统后铁死亡的敏感性至关重要，基于铁死亡的治疗是晚期/耐药性LUAD患者的理想选择。

本文研究强调了在抑制XC-系统后，积累的内源性谷氨酸对增强铁死亡的重要性。ADCY10/PKA/GFPT1信号转导轴对YAP抑制的程度决定了LUAD细胞铁依赖的铁死亡敏感性。ADCY10同时在LUAD中发挥致瘤作用和铁死亡效果。因此，ADCY10表达升高的患者更可能受益于基于铁死亡的治疗，铁死亡可能是治疗癌症的新选择。本文机制研究的思路写的很清楚，蛋白质组学为揭示机制做出了重要贡献。

参考文献：

1. Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, Skouta R, Zaitsev EM, Gleason CE, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012; 149: 1060-72.

2. Bridges RJ, Natale NR, Patel SA. System xc(-) cystine/glutamate antiporter: an update on molecular pharmacology and roles within the CNS. Br J Pharmacol. 2012; 165: 20-34.

3. Lee J, You JH, Shin D, Roh JL. Inhibition of Glutaredoxin 5 predisposes Cisplatin-resistant Head and Neck Cancer Cells to Ferroptosis. Theranostics. 2020; 10: 7775-86.

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云起 撰文

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