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老年骨骼肌表现出酰基链饱和的脂质体特征

随着年龄的增长，骨骼肌中FABP3表达显著增加，而心肌中则没有(图1a)。使用UPLC/QTOF质谱分析了“年轻”(3个月大)和“老年”(24个月大)小鼠胫骨前肌的脂质特征。鉴定了203种脂类。大约有53%的脂质种类发生了显著变化，其中45种脂类增加，62种脂类减少(图1b)。老年肌肉SM和LPC升高，分别比年轻肌肉增加2.4倍和2.8倍(图1c)。我们接着分析了在年老肌肉和年轻肌肉中检测到的PC、PE、SM和LPC的酰基链组成。在老年肌肉中，16:0/20:4 PC显著下降24%，而在年轻肌肉中16:0/16:0 PC显著增加2.1倍，其他PC种类的变化较小或不显著(图1d)。在老化肌肉中双键较多的PEs减少，而双键较少的PEs增加。这些数据表明，PC和PE酰基链在老年肌肉中由多不饱和向饱和转变。同时，我们评估了PC酰基链的长度。C18和>C18脂肪酸水平的变化反映了极长链脂肪酸(VLCFA)延长酶的活性。链长与VLCFAs19的不饱和程度有关。如预期的那样，酰基链长和不饱和程度是相关的。老化肌肉C18酰基链水平升高，而>C18酰基链下降(图1i)。总之，老年骨骼肌表现出独特的酰基链饱和脂质体特征。这些结果促使我们研究衰老骨骼肌中FABP3的上调是否参与了这种脂质重塑。

过表达FABP3后年轻肌肉表现出类似于衰老肌肉的脂质成分

为了研究FABP3对肌内脂质组成的影响，我们将编码HA-cherry FABP3或HA-cherry对照的质粒转染到年轻的胫骨前肌肉中。通过脂质体分析，我们发现过表达FABP3增加了53种脂类，减少了32种脂类(图2a)。具有显著变化的脂类种类占已鉴定脂类总数的近一半，表明FABP3在肌肉脂类重塑中发挥重要作用。相比年轻肌肉,FABP3过表达后SM和LPC增加(图2 b)，类似于年老肌肉(图1 c)。与年轻肌肉相比，含有多不饱和酰基链的PCs(如16:0/22:6、18:0/22:6、18:2/22:6、18:1/22:6)在过表达FABP3的肌肉中减少。相比之下，含有18:1/18:2、18:0/18:2、16:0/16:0酰基链的PCs增加(图2c)。在过表达FABP3的肌肉中，饱和PC酰基链增加，而多不饱和酰基链减少(图2g)。PC酰基链长度方面，在过表达FABP3的肌肉中，C18酰基链增加，而>C18酰基链减少，与老化肌肉相似(图2h)。在这些脂质组数据上，我们认为FABP3有助于肌肉老化过程中的脂质改变。

图2

FABP3通过PERK-eIF2 通路抑制蛋白质合成

考虑到膜脂饱和增加会引起内质网应激反应，我们研究了老年小鼠肌肉中的内质网应激反应。研究发现老化肌肉中内质网应激传感器PERK(胰腺内质网激酶)的磷酸化增加(图3a)。与之前研究数据PERK磷酸化、eIF2磷酸化抑制蛋白翻译一致，我们检测到老化肌肉中eIF2的磷酸化增加，新生蛋白合成减少了50%(图3a)。因此，我们下一步研究通过FABP3过表达的脂质重塑是否会在体内诱导内质网应激。小鼠肌肉过表达FABP3增加了PERK和eIF2的磷酸化，并减少了约40%的蛋白合成(图3b)。这些结果表明，在老年骨骼肌中，FABP3诱导的脂质重塑可能引起内质网应激反应和蛋白质合成缺陷。为了进一步证实FABP3在内质网应激信号传导和蛋白合成中的作用，我们建立了稳定的C2C12细胞系，在Cre重组酶的控制下过表达FABP3。FABP3过表达增加了分化C2C12肌管中的PERK磷酸化。此外，过表达FABP3增加了eIF2的磷酸化，抑制了新生蛋白的合成(图3c)，这种情况比使用众所周知的内质网应激诱导剂棕榈酸酯处理的肌管更为严重。

图3

FABP3过表达降低了肌管细胞的膜流动性

由于脂质成分影响膜流动性，我们研究了FABP3诱导的脂质重塑是否会影响肌细胞膜流动性。为此，我们通过FRAP分析4,4-difluoro-5-methyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoic acid (BODIPY 500/510 C1, C12)在肌管中的膜脂扩散率(图3d)。与之前的报道一致，经过棕榈酸处理，BODIPY 500/ 510 C1, c12标记的肌管在漂白后50秒荧光增益下降了36%(图3e)。令人惊讶的是，过表达FABP3的肌管膜的扩散速率与棕榈酸处理的肌管相似。对照组、棕榈酸处理组和过表达组肌管的最大荧光增益时间分别为41.33、49.58和52.87 s(图3e)。这些结果表明，FABP3降低了膜的流动性。

FABP3过表达会导致肌肉质量和肌力下降

接下来我们研究了骨骼肌中FABP3水平的生理意义。与年轻小鼠相比，年老小鼠的肌肉在固定化后恢复是不完全的或延迟的。因此，我们评估了过表达FABP3的TA肌肉在固定5天后的肌肉萎缩和肌肉恢复情况(图4a)。虽然过表达FABP3的TA肌肉和对照TA肌肉的萎缩形态相似，但在再恢复过程中，对照年轻肌肉恢复了肌肉质量，而过表达FABP3的肌肉则没有恢复肌肉质量(图4b)。此外，免疫组化分析显示，去脂后过表达FABP3的肌肉比对照肌肉显示出更小的肌肉纤维，与衰老肌肉相似(图4c, d);同时，western blot分析显示，在再磷酸化过程中，FABP3保持了高水平的PERK和eIF2的磷酸化，并抑制了蛋白的合成(图4e)。这些结果共同表明，在衰老过程中，FABP3的上调会降低肌肉质量和力量。

图4

衰老肌肉中FABP3的抑制导致年轻化的脂质组成

为了证实FABP3与年龄相关的脂质重塑的相关性，我们使用shRNA对衰老TA肌肉中fabp3进行敲除。对FABP3沉默肌肉的脂质组分析显示，在衰老肌肉中发现的总脂质种类有64%发生了改变，21种脂质种类增加，79种脂质种类减少(图5a)。SM和LPC的水平分别减少了54%和53%(图5 b)。接着分析了磷脂酰基链的组成。值得注意的是，含有多不饱和酰基链的16:0/22:6、18:0/22:6、18:2/22:6的PCs在FABP3- knockdown肌肉中增加(图5c)，而含有16:0/16:0、18:1/18:2、18:0/18:2的PCs则减少。在fabp3基因敲除的肌肉中，多不饱和PC酰基链增加，而饱和酰基链减少(图5g)。这些结果共同表明，fabp3抑制能在衰老肌肉中再现年轻肌肉脂质组成。

图5

抑制FABP3可以改善膜的流动性

为了研究抑制FABP3是否能保护鼠内质网应激，我们检测了内质网应激下衰老小鼠肌肉中FABP3的表达。fabp3基因敲除降低了PERK和eIF2的磷酸化，提高了亲丁氨酸的合成(图6a)。在C2C12肌管中，fabp3敲除降低了棕榈酸诱导的PERK-eIF2磷酸化并改善了蛋白合成(图6b)。为了研究抑制FABP3是否能重建棕榈酸盐处理后失去的膜流动性，我们对C2C12肌管fabp3敲除进行了FRAP分析。与对照组细胞相比，在棕榈酸盐存在的情况下，FABP3敲除肌管中FRAP信号显著增加(图6c中浅蓝标志和深蓝标志)。结合显示FRAP信号降低的FABP3过表达数据(图3)，我们认为衰老肌肉中FABP3的增加可能降低膜流动性和内质网应激反应。

图6

抑制FABP3可改善年龄相关性肌肉恢复障碍

我们研究了FABP3的下调是否能改善衰老小鼠TA肌肉的恢复(图8a)。在固定化过程中，fabp3抑制会减缓肌肉损失，在再恢复过程中显著增加肌肉质量(图8 b)。免疫组化分析显示，在去脂化后，fabp3基因敲除老化肌肉中的肌肉纤维明显大于对照老化肌肉(图8c, d)。fabp3基因敲除维持了较低水平的PERK和eIF2磷酸化，并改善了再活化过程中的蛋白质合成(图8e)。接下来，为了评估FABP3对老年骨骼肌功能的影响，我们比较了FABP3抑制肌肉和老年肌肉的体外肌收缩性。当受到疲劳诱导的重复刺激时，FABP3-knockdown肌肉比老化肌肉更抗疲劳(图8i)。总之，这些结果表明fabp3基因敲除可以改善与年龄相关的肌肉质量和力量下降，因此可以作为一个潜在的有价值的治疗靶点。

图8