迈维星光 | 转酮醇酶缺乏通过增加核糖-5-磷酸和核苷酸水平保护肝脏免受DNA损伤

 ● 期刊：Cancer Research 

 ● IF=9.13

 ● 发表时间：2019-05-17

新的核苷酸生物合成是维持细胞核苷酸库所必需的，它的抑制会导致基因组不稳定。戊糖磷酸途径(PPP)非氧化分支的代谢酶转酮醇酶（TKT）调节核糖5-磷酸(R5P)水平和新的核苷酸生物合成。TKT是维持人肝癌细胞增殖所必需的。但TKT在调控新的核苷酸生物合成和基因组稳定性方面的潜在作用仍有待阐明。

肝脏特异性TKT缺陷小鼠

作者将TKT^flox/^flox小鼠与Albumin-Cre小鼠杂交，获得了肝脏特异性TKT 基因敲除小鼠，并利用二乙基亚硝胺（DEN）诱导急性肝损伤。再通过代谢组学、RT-PCR、免疫组织化学与免疫荧光、免疫荧光染色与共聚焦显微镜等实验方法，确定了TKT在肝损伤和肿瘤发生过程中促进基因组不稳定的关键作用。因此，靶向TKT可能是一种新的肝癌防治方法。

TKT的损失不会干扰肝脏发育

在基因敲除小鼠中和对照小鼠对比，TKT蛋白在肺组织和白色脂肪组织中的表达没有改变(Fig. 1C)；体重和肝脏重量没有改变(Fig. 1D and 1E)；没有观察到任何明显的表型异常或血清丙氨酸转氨酶的任何显著变化(Fig. 1F and 1G)；接下来，作者调查了TKT的缺失是否影响了肝脏的发育。通过对肝脏发育关键转录因子HNF1α、HNF4α,、GATA4、ATF1和ALB的mRNA的表达水平检测，发现在基因敲除小鼠和对照小鼠中没有发现明显的改变(Fig. 1H)；另外在肝脏中对于药物、毒素、致癌物等异物的代谢至关重要的Cytochrome P450 2E1 (CYP2E1)的mRNA的表达水平也没有发生改变(Fig. 1H)，通过以上结果得知，TKT可能不是肝组织发育所必需的。

TKT缺乏减轻DEN暴露后肝损伤

为了判定TKT在急性肝损伤中的作用，作者采用二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine, DEN)诱导肝损伤，48h后检测不同处理小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）的含量，发现缺乏TKT显著降低了DEN暴露后血清ALT水平，表明肝脏损伤减轻(Fig. 2A)；蛋白免疫印迹法证实，DNA损伤的标记蛋白γ-H2A.X的表达减少(Fig. 2B)；细胞坏死标志蛋白-受体相互作用蛋白3（RIP3）的表达也相应地减少(Fig. 2C)；免疫组化实验证实O(6)-乙基-2''-脱氧鸟苷含量发生轻微变化，表明TKT的缺失不影响DEN的代谢(Fig. 2C-E)；Ki 67免疫染色显示缺乏TKT的肝损伤区代偿细胞增殖水平显著降低。透射电镜分析进一步证实TKT缺乏症可减轻DEN所致的肝细胞坏死(Fig. 2H)。以上实验表明TKT缺乏症减轻DEN暴露后肝DNA损伤、坏死和代偿性增殖。

TKT对在肝损伤过程中从PPP到糖酵解途径的碳分流是关键的

TKT催化非氧化性PPP中的可逆反应，其与糖酵解途径交换代谢产物。为了验证TKT的丧失可重新引导细胞代谢，作者采用代谢组学方法检测不同处理组小鼠肝脏组织代谢物变化情况。有趣的是，TKT缺乏的肝脏中某些非氧化ppp代谢物如核酮糖/5-磷酸木糖和核苷酸如IMP、AMP和GMP增加。另外，DEN暴露处理的小鼠体内糖酵解相关代谢物减少，如G6P、F6P、GAP等，PPP相关代谢物在DEN暴露的TKT缺乏肝脏组织中呈积累趋势，如核酮糖-5-磷酸（R5P）、核酮糖-5-磷酸（Ru5P）、木酮糖-5-磷酸（Xu5P），而S7P含量减少。表明TKT的丢失导致R5P的积累和氧化相利用率的降低。TKT对于协调PPP和糖酵解的非氧化和氧化相之间的碳流动至关重要。作者又采用同位素光谱分析（ISA）DEN暴露后肝脏代谢物变化情况，结果表明TKT的丢失阻碍了从PPP到糖酵解途径的碳流动，导致R5P的积累和核苷酸生物合成的上调，以保护肝损伤。

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TKT的丢失通过增加核苷酸水平保护肝脏免受DEN诱导的DNA损伤

鉴于TKT缺失使R5P和核苷酸水平升高加上TKT缺陷可减轻DEN暴露后的肝损伤，作者推测de novo核苷酸生物合成可能保护细胞免受DNA损伤。然后经过碱性彗星试验发现在TKT缺乏小鼠中DNA损伤减轻，进一步通过蛋白免疫印迹法表明外源性核苷酸的补充降低了DNA损伤诱导的TKT未缺失小鼠原代肝细胞凋亡和坏死。这些数据共同表明，TKT在肝细胞中的丢失通过增加PPP氧化分支产生的R5P和核苷酸水平来保护DEN诱导的小鼠肝损伤。

TKT缺失抑制肝癌的发生

作者进一步探究TKT缺乏症是否能减轻肝癌的发生，使用建立完善的DEN注射方案诱发肝癌，发现TKT的丢失大大减少了肿瘤数量。为了全面阐明TKT对肝癌代谢途径的影响，我们在体内利用UHPLC-qTOFMS进行了同位素光谱分析实验。作者发现TKT缺乏小鼠PPP中间体Ru5P和核苷酸如IMP、UMP、GMP和dGMP的相对富集量显著增加。提示TKT在体内调控肝脏肿瘤新核苷酸生物合成中起重要作用。

TKT的丢失延缓了DEN和HFD引起的肝脂肪变性、肝硬化和肝癌的发生

为进一步探讨TKT缺乏症在肝癌发生中的保护作用，对TKT缺乏小鼠进行了组织学和病理分析。值得注意的是，TKT在肝脏中的丢失不仅减轻了DEN和HFD所致的肝脂肪变性。同时Masson染色显示肝硬化程度降低。这些结果清楚地表明，TKT的丢失延缓了DEN和HFD诱导的小鼠肝癌的发生和发展。

TKT的丢失促进肝癌细胞凋亡，减少细胞增殖，降低肿瘤坏死因子-α、IL-6和STAT 3水平

为了探讨DEN和HFD诱导小鼠肝癌发生的机制，作者进一步研究了TKT在肝癌代偿性增殖和凋亡中的作用。发现缺乏TKT的小鼠肝组织中p-STAT 3和NF-κB亚基p65的核定位降低。此外，缺乏TKT的小鼠肝组织中IL-6、TNF-α和STAT 3水平明显降低。综上所述，这些数据表明TKT的丢失促进了细胞的凋亡，减轻了炎症反应，从而降低了增殖和肝癌的生长。

本研究通过将TKT^FLOX/^FLOX小鼠与Albumin-Cre小鼠杂交，获得了肝脏特异性TKT基因敲除小鼠株。TKT在肝细胞中的丢失保护肝脏免受二乙基亚硝胺(DEN)引起的DNA损伤，而不改变DEN代谢。DEN处理TKT缺乏肝脏可提高R5P水平，促进新的核苷酸合成。更重要的是，在原代肝细胞中补充dNTPs可以减轻DEN引起的DNA损伤、细胞死亡、炎症反应和细胞增殖。此外，与对照组相比，DEN和高脂饮食(HFD)诱导的小鼠肝癌发生减少。机制上，TKT在肝脏中的丢失增加了细胞凋亡，降低了肿瘤坏死因子-α、IL-6和STAT 3水平，减轻了DEN/HFD诱导的肝脂肪变性和纤维化。总之，我们的数据确定了TKT在肝损伤和肿瘤发生过程中促进基因组不稳定的关键作用。

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