文献解读 | 代谢组学和脂质组学的结合揭示了三氯生对人肝细胞毒性的代谢机制

 ● 期刊：Environmental Science & Technology

 ● IF=6.653

 ● 发表时间：2019-04-18

三氯生(TCS)是一种广泛应用的抗菌药物，由于其具有致癌潜能，引起了人们的广泛关注。然而，以往的肝毒性研究主要集中在特定细胞内受体的激活上，其潜在机制仍需在代谢水平上进一步研究。因此，作者应用代谢组学和脂质组学相结合的方法来揭示人正常和癌变肝细胞中TCS相关的代谢反应。对内源代谢产物和外源代谢产物进行了分析，以鉴定代谢生物标志物和生物转化产物。

人正常肝细胞株L02和人肝癌细胞株HepG 2

以人正常肝细胞L02细胞株和肝癌细胞株HepG 2为模型体系，首先研究了TCS对细胞活力的影响，探讨了TCS对细胞的毒性作用。又采用基于质谱的代谢组学和脂质组学方法来评价细胞对TCS暴露的代谢反应。为了更好地了解毒性机制，还对TCS的生物转化进行了研究。进一步测定了TCS处理细胞的活性氧(ROS)生成和抗氧化反应，以评价细胞的氧化应激。

代谢组学揭示TCS处理细胞后潜在代谢标志物及干扰的代谢途径

Figure 1  TCS处理组及对照组细胞代谢物PLS-DA得分图

Figure 2  L02和HepG 2细胞代谢组学数据火山图

由图可知对照组与TCS处理组间有显着性差异，提示TCS可引起细胞内代谢产物的明显改变。TCS对肝细胞的影响呈剂量依赖性，且在相同的TCS浓度下（1μM），L02细胞代谢物特征的变化明显大于HepG 2细胞，高TCS浓度下结果也一样，表明TCS可导致正常肝细胞代谢谱发生更严重的改变。

■ ■■■■

Figure 3  L02和HepG 2细胞代谢物通路分析

这些生物标志物主要包括氨基酸、肽、核苷酸、羧酸、磷脂和酰基肉碱。根据KEGG通路数据库，TCS干预后代谢产物的显著变化与肝细胞丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢、嘌呤代谢、三羧酸(TCA)循环紊乱密切相关，其中最相关的代谢途径是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径。此外，TCS暴露对L02细胞的牛磺酸和低牛磺酸代谢以及HepG 2细胞的谷胱甘肽代谢也有显著影响。接下来作者对胞内氨基己酸代谢途径进行了研究。

TCS暴露与氨基酸代谢和嘌呤代谢紊乱

Figure 4 TCS作用下已鉴定代谢物生物标志物代谢途径的变化

对TCS作用下已鉴定代谢物生物标志物丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及嘌呤代谢途径的变化进行研究，该途径的下游代谢物含量显著升高，与高剂量组和对照组相比，丙酮酸、延胡索酸和琥珀酸在L02细胞中的FCs分别为1.50、2.00和1.76。HepG 2细胞中丙酮酸(FC 1.44)、延胡索酸(Fc 1.92)和α-酮戊二酸(FC 2.46)的水平升高，根据FCs结果，TCS处理的L02细胞内17种氨基酸含量下降，其中10种呈剂量依赖性下降，提示细胞内氨基酸代谢加速。此外，在HepG 2细胞中，12种氨基酸在低或高TCS暴露浓度下也成呈下降趋势，这可能是由于细胞外营养物质导入癌细胞的促进作用所致。

■ ■■■■

Figure 5 TCS对L02和HepG 2细胞内氨基酸的干扰

找到了差异代谢物主要集中在氨基酸代谢通路后，作者对涉及到的胞内20种氨基酸含量进行研究。TCS干预也被认为是正常和癌变肝细胞嘌呤代谢紊乱的重要原因。嘌呤代谢处于核酸降解的下游。在TCS处理的L02细胞中，所有已鉴定的下游中间水平都显著升高，提示这一代谢途径的上调。次黄嘌呤和黄嘌呤是产生过氧化氢(H2O2)的黄嘌呤氧化酶（XOD）的底物。高剂量TCS暴露后，L02细胞的XOD活性明显增强。因此，嘌呤代谢上调是正常肝细胞活性氧的重要来源。然而，在TCS处理的HepG 2细胞中，次黄嘌呤浓度下降，而黄嘌呤浓度无明显变化。

■ ■■■■

Figure 6 TCS诱导肝细胞N-乙酰谷氨酸和胞内氨的变化

肝脏中氨基酸的氧化脱氨是内源性氨的主要来源。氨的产生主要是通过谷氨酸的α-氨基氮。TCS处理后L02细胞谷氨酸水平下降，HepG 2细胞谷氨酸水平升高，提示可能存在氨形成障碍。肝细胞丙氨酸的下调暗示着氨的潜在积累。另一个重要的证据是氨的过量生产是N-乙酰谷氨酸的升高，N-乙酰谷氨酸是磷酸氨基甲酰合成酶Ⅰ(CPS 1)的一种重要的变构激活剂，它是尿素循环的限速酶。当肝氨浓度增加时，会激活谷氨酰胺酶，提高线粒体内N-乙酰谷氨酸的水平；反过来，通过激活CPS 1，将氨转化为尿素排泄。在本研究中，TCS处理诱导L02细胞(FC 1.49)和HepG 2细胞(FC 5.98)N-乙酰谷氨酸显著增加。此外，通过对氨水平的量化，我们直接证明了TCS处理后细胞内氨含量的升高。这些结果清楚地表明，TCS暴露导致人肝细胞氨基酸代谢上调。

Figure 7 TCS引起的脂类生物标志物的变化

TCS暴露与脂质代谢紊乱

作者又从脂质代谢物层面对TCS暴露引起的物质变化进行了研究，由图可知TCS处理后在L02细胞中palmitoylcarnitine (C16)， tetradecanoylcarnitine (C14)和HepG 2细胞中isobutyrylcarnitine (C4)含量急剧增加。另外，L02细胞中的3种代谢产物和5种HepG2细胞代谢产物参与甘油磷脂代谢。甘油磷酸胆碱是胞质溶胶中胆碱储存的一种形式，其含量在TCS处理的肝细胞中显著降低。胆碱是卵磷脂(PCS)的主要来源，在L02和HepG2细胞之间表现出相反的变化趋势。作为PC的氧化代谢物，在L02细胞中，LPC(16∶0)上调，而LPC(14∶0)和LPC(16∶0)在HepG2细胞中下调。这些生物标志物的变化表明，TCS可引起细胞间脂质调节紊乱，正常肝细胞与癌性肝细胞之间可能存在不同的功能障碍。

Figure 8 脂质组学分析TCS诱导的亚类脂质变化

通过脂质组学分析，进一步研究了这些异常脂质代谢。在L02细胞中甘油三酯(TG)、二酰甘油(DG)、PC、PE、磷脂酰甘油(PG)，LPC， LPE， 神经酰胺 (Cer)，鞘磷脂(SM)的丰度有显著的上调，多磷酸肌醇(PI)的丰度明显下降。而在HepG2细胞中DG、PC、PE和SM的亚类脂质显著增加，TG、PG、PI、LPC、LPE和Cer降低。

■ ■■■■

Figure 9 TCS暴露引起细胞内脂质物质变化的PLS-DA评分图和火山图

■ ■■■■

Figure 10 L02细胞和HepG 2细胞脂类生物标志物热图分析

作者根据VIP值、P值和FCs，进一步筛选脂类生物标志物。在TCS处理的L02细胞中，除个别PC外，脂类生物标志物普遍上调，TCS呈剂量依赖性增加，提示TCS可诱导正常肝细胞内TG的积累。作为磷脂的两个主要组分，PC和PE的含量显著提高，说明细胞膜的动态平衡被破坏；LPC水平显著上调，作为肝脏脂质毒性的重要证据；PG水平的显著升高提示TCS对线粒体膜结构有一定的干扰作用；Cer在TCS处理后上调是激活凋亡级联的重要信号，较高的CER含量可以促进活性氧（ROS）的产生。在TCS处理的HepG2细胞中TG的耗竭可能是由于能量需求增加或脂肪酸合成减少所致；Cer生成和SM代谢方面也存在缺陷。已有的研究也表明低Cer水平的恶性细胞对凋亡具有抗性，本研究中，HepG 2细胞Cer水平的下降为TCS暴露后细胞凋亡的耐药特性提供了证据，这可能有助于TCS相关的人肝癌的发展。

Figure 11细胞暴露于TCS后肝细胞能量代谢紊乱图

TCS暴露与能量代谢紊乱

上文提到PG水平的显著升高提示TCS对线粒体膜结构有一定的干扰作用，以及Cer增强可直接导致作用于线粒体呼吸电子链的ROS的产生，所以作者又对TCS与细胞能量代谢之间的关系进行了研究。在L02和HepG 2细胞中，随着TCS剂量的增加，丙酮酸和乳酸水平呈上升趋势，提示细胞质中糖酵解的上调；在TCS处理的HepG 2细胞中观察到种谷氨酰胺和谷氨酸的水平升高，说明谷氨酰胺代谢产生的能量也应加强。因此，TCS诱导的能量增强可能有助于促进癌细胞的增殖。

TCS处理的肝细胞TCA周期的成分，包括柠檬酸盐、延胡索酸和苹果酸盐明显上调，此外，在L02细胞中琥珀酸水平升高，HepG 2细胞中α-酮戊二酸水平升高。TCS也是一种线粒体解偶剂，能破坏膜电位，抑制SDH(CompleII)活性，从而促进ROS的产生；琥珀酸盐被认为是一种共代谢物，其在线粒体中的积累与肿瘤的进展有关。氧化磷酸化过程中电子传递链产生的线粒体活性氧是细胞氧化负荷的主要来源，因此，TCS诱导的TCA周期的上调可能导致线粒体ROS的积累，从而进一步增强正常肝细胞的氧化应激。

TCS在肝细胞中的生物转化

Figure 12 标准品和细胞样品中TCS的色谱图和MS光谱

Figure 13 暴露48h后培养液中TCS浓度的检测

作者对TCS在包内的代谢过程进行了研究。结果证明了TCS在肝癌细胞中的快速生物转化，TCS在肝内经细胞色素P450酶的催化下，TCS形成羟基化代谢产物(OH-TCS)，因此，TCS对HepG 2细胞的毒性较低，部分原因在于其快速生物转化为结合代谢物和排毒排泄。

Figure 14 TCS诱导的肝细胞氧化损伤及抗氧化反应

在以上分析的基础上，作者推测ROS在肝细胞内过度生成，改变了细胞内氧化还原状态，加重了代谢功能障碍。为验证ROS的过度产生，用H2DCF-DA荧光探针对实时生成的ROS进行了成像。TCS处理组L02和HepG 2细胞的荧光信号强度明显强于对照组，且在L02细胞中荧光信号强度远高于HepG2细胞，说明TCS诱导ROS过度积累，并在肝细胞内创造了一个氧化前环境。因此，TCS诱导的氧化应激是引起正常肝细胞毒性的关键因素之一，TCS处理的癌细胞抗氧化防御系统的升高促进了肝癌的发生。

ROS产生和氧化应激标记

在以上分析的基础上，作者推测ROS在肝细胞内过度生成，改变了细胞内氧化还原状态，加重了代谢功能障碍。为验证ROS的过度产生，用H2DCF-DA荧光探针对实时生成的ROS进行了成像。TCS处理组L02和HepG 2细胞的荧光信号强度明显强于对照组，且在L02细胞中荧光信号强度远高于HepG2细胞，说明TCS诱导ROS过度积累，并在肝细胞内创造了一个氧化前环境。因此，TCS诱导的氧化应激是引起正常肝细胞毒性的关键因素之一，TCS处理的癌细胞抗氧化防御系统的升高促进了肝癌的发生。

对毒性机制的认识

本研究为人类肝细胞中与环境剂量相关的TCS诱导的毒性代谢机制提供了直接证据。根据所得结果，推导出TCS肝毒性的可能机制如下。TCS作为一种异源体，激活核受体CAR并被细胞色素P450酶代谢，触发氧化应激。随着适应性反应，嘌呤代谢和氨基酸代谢上调，脂质代谢和能量代谢受到干扰。这些代谢障碍反过来又增强了ROS的过度产生，主要来自XOD活性和线粒体功能障碍，然后加剧了氧化损伤。TCS对人HCC发育的潜在机制包括能量代谢的上调、抗氧化防御系统的提升和通过II期代谢快速解毒。此外，本研究还表明，代谢组学是同时鉴定生物样品内源性和外源性代谢物的有力策略。这里提供的信息是有助于提高当前对TCS诱导的肝毒性的理解。未来的研究将包括人体体液中TCS相关的代谢组学研究，以进一步解释机制。

1、TCS可导致正常肝细胞代谢谱发生更严重的改变；

2、TCS暴露导致人肝细胞氨基酸代谢上调；

3、TCS可引起细胞间脂质调节紊乱；

4、TCS诱导的TCA周期的上调可能导致线粒体ROS的积累，从而进一步增强正常肝细胞的氧化应激；

5、TCS在肝癌细胞中的快速生物转化；

6、TCS诱导的氧化应激是引起正常肝细胞毒性的关键因素之一；

7、TCS处理的癌细胞抗氧化防御系统的升高促进了肝癌的发生；

8、TCS毒性机制推倒：作为一种异源体，激活核受体CAR并被细胞色素P450酶代谢，触发氧化应激。

1、 本研究为人类肝细胞中与环境剂量相关的TCS诱导的毒性代谢机制提供了直接证据；

2、 本研究证明了代谢组学是同时鉴定生物样品内源性和外源性代谢物的有力策略；

3、 本研究有助于提高当前对TCS诱导的肝毒性的理解。