文献解读 | 肠道微生物来源的苯基硫酸盐导致糖尿病肾病中的蛋白尿

 ● 期刊：nature Communication

 ● IF=12.3

 ● 发表时间：2019-05

糖尿病患者中大约有20%~30%会发展成糖尿病肾病（Diabetic kidney disease, DKD），而糖尿病肾病是终末期肾病、心血管疾病和死亡的主要原因。仅测量肾小球过滤率和蛋白尿，很难识别可能发展成为DKD的糖尿病人，因此，需要寻找到特定的生物标志物来识别糖尿病早期阶段的高危并发症患者。

     在肾脏中，有机阴离子转运多肽（OATP）转运蛋白家族有助于将各种有机阴离子和阳离子转运到尿液中。在啮齿动物肾脏中，近端小管存在几种oatp基因产物，而SLCO4C1是人类肾脏中唯一的OATP。本研究利用了SLCO4C1过表达转基因大鼠，结合代谢组研究发现肠道微生物代谢产生的苯基硫酸盐（phenyl sulfate, PS）和蛋白尿有显著相关，抑制PS的产生可以减少糖尿病小鼠的蛋白尿。

第0天采用链脲霉素诱导产生SLCO4C1转基因大鼠（SLCO4C1-Tg）糖尿病模型（Tg-DM）和野生型大鼠糖尿病模型（WT-DM）。7天后，筛选保留血糖在300mg/dl以上的大鼠。WT-DM和Tg-DM的饮食摄入和体重相似，造模期间两组血糖浓度也相近，但第90天除外（图1a）。两组的肾功能没有明显差异，但在第7、30和63天时候，Tg-DM的蛋白尿显著低于WT-DM（图1a）。组织学切片显示WT-DM肾小球明显肿大，而Tg-DM减轻（图1b）。以上数据表明，Tg-DM蛋白尿减少，但是组织学显示没有太大变化。

SLCO4C1是人体中将代谢物转运到尿液中的转运因子，基于此作者推断SLCO4C1特异配体，从而降低蛋白尿水平。代谢组分析，PLS-DA模型显示WT-DM和Tg-DM有明显差异。利用OPLS-DA模型找寻差异代谢物。S-plot显示94个代谢特征在WT-d119组中显著增加（图1d）。这些特征中，质荷比为172.97的代谢物对OPLS-DA模型有显著贡献。后续表明此代谢物是唯一随着糖尿病发展而增加，同时在Tg-DM中有降低的特征（图1e-g）。进一步分析确认其为苯基硫酸盐（phenyl sulfate, PS）。

后续作者通过表达SLC04C1的MDCK细胞和人近端管状HK2细胞进行PS摄取实验，证实PS为SLCO4C1转运子的受体（图1j）。由此发现，PS随着糖尿病的发展而增加，肾脏SLCO4C1过表达可降低蛋白尿和PS的累积。

图1

为了确认PS是否在蛋白尿和糖尿病肾损伤发展中起致病作用，给db/db小鼠口服50mg/kg PS。6周后，血浆PS浓度相较对照组增加5倍（图2a）。PS是肠源的尿毒症毒素，作者同时测定了其他肠源毒素水平（对甲酚硫酸盐PCS、吲哚酚硫酸盐IS和氧化三甲胺TMAO），发现这三个物质在两组间没有显著差异（图2a）。口服PS6周后，蛋白尿显著增加（图2b）。

足细胞损伤是引起蛋白尿的原因，作者进一步研究了PS对足细胞的影响。光镜组织学检查显示系膜扩张，但不显著（图2c）。然后电子显微镜显示PS处理的db/db小鼠中，足突消失(图2c，白色箭头)和肾小球基底膜厚度增加(图2c，黄色箭头)。作者又用分化的人尿足细胞上皮细胞（HUPECs）验证PS对足细胞的毒害作用。PS浓度为30μM的时候，毒性开始显现，在100μM后出现显著毒性（图2d）。有文献表明，PS可以降低谷胱甘肽浓度，致使细胞容易受到氧化应激的损伤。100μM PS处理分化足细胞后，谷胱甘肽浓度显著降低（图2e）。由于足细胞线粒体功能障碍与DKD发病机制相关，作者探究了PS对足细胞能量代谢的影响，发现PS显著降低了线粒体基础呼吸、ATP产生和最大呼吸能量（图2f），表明PS具有线粒体毒性。

图2

除了动物模型之外，作者有分析了362例糖尿病人数据。血浆PS水平分析如图3a所示。Spearman相关分析显示PS和蛋白尿/肌酐（ACR）及估计的肾小球过滤率（eGFR）显著相关，与可溶性尿激酶型纤溶酶原激活受体（suPAR，已知和DKD发病及发展有关）无显著相关性。接下来，作者通过多元回归分析，构建原始模型、已知影响因子矫正模型（矫正因子：年龄、性别、BMI、SBP、HbA1c、log（eGFR））和所有临床指标矫正的模型。分析显示，ACR是唯一在三种模型中都和PS显著相关的因子（表2）。反过来，将ACR作为目标变量时，PS在三种模型中都和ACR显著相关（表2）。

基于疾病的不同时期，作者采用了分层逻辑分析。由于大量蛋白尿患者较少，作者只分析了无蛋白尿和微量蛋白尿患者。在无蛋白尿组，PS和两年ACR变化量不相关，而在微量蛋白组，PS是所有三个模型中与两年ACR变化量相关的唯一因素，模型2中的优势比为2.02（CI：1.04-3.92）（图3e）。但是，suPAR在两组中都不相关。ROC分析显示单独已知因子为0.713，而结合PS后提高至0.751（图3f）。结合suPAR或suPAR和PS分别提高至0.725和0.752（图3g，h）。综上可以得出结论，PS和ACR相关，并且可以预测DKD患者两年ACR恶化的程度。

图3

肠道菌群参与PS的产生，肠道菌群独有的酪氨酸酚裂解酶（tyrosine phenol-lyase，TPL）将食物中的酪氨酸转化为苯酚，苯酚在生物体肝脏中进一步代谢为PS（图4a）。TPL仅在少数肠杆菌科中表达，真核生物不表达。因此，抑制TPL可能降低血浆中PS浓度，且对宿主无损伤。作者考察了2-重氮酪氨酸和L-间酪氨酸，这两种TPL抑制剂对血浆PS、蛋白尿和肾功能的影响。口服给与db/db小鼠2-重氮酪氨酸一周（10mg/kg/day），血浆中PS、IS和PCS显著降低（图4b）。两周后，随着糖尿病发展而增加的蛋白尿可被2-重氮酪氨酸回调（图4c）。相同的，L-间酪氨酸也可以降低血浆PS和IS浓度。以上数据表明，TPL抑制剂可减少蛋白尿、PS和IS水平，因此有保护糖尿病小鼠肾脏的作用。

作者通过腺嘌呤诱导肾衰竭小鼠模型，以此验证2-重氮酪氨酸对肾脏保护作用。肾衰竭模型小鼠血浆中PS、IS、PCS和TMAO显著增加（图4d）。使用2-重氮酪氨酸处理后，血浆肌酐水平显著下降，PS和IS也有明显降低的趋势，但不显著。质谱成像技术显示肾衰竭小鼠的肾皮质中PS和IS水平显著增加，而2-重氮酪氨酸处理后发生回调（图4e）。同时通过LC-MS/MS靶向定量检测验证了上述发现（图4f），另外，2-重氮酪氨酸处理可改善肾衰竭导致的管状区域损伤（图4g）。

图4

 通过16s RNA检测肾衰竭小鼠粪便中肠道菌群组成，结果显示2-重氮酪氨酸对肠道菌群组成没有重大改变（图5a-c）。作者后续关注了血浆PS浓度正相关并且2-重氮酪氨酸处理后丰度降低的菌群，目水平上，90%以上的肠道菌群不符合该条件（图5d），但丰度较小的两类（科里杆菌属和丹毒菌目）在肾衰竭小鼠中显著增加，而2-重氮酪氨酸处理后明显降低（图5e），在科水平上结果相同。在属水平上，12个主要的属没有变化，但Adlercreutzia 和unclassified Erysipelotrichaceae与血浆PS浓缩呈正相关，说明这两小类菌群可能在一定程度上影响血浆PS浓度。有TPL活性的Enterobacteriaceae科丰度低于0.1%，且和血浆PS无相关性。另外，终止给予L-间酪氨酸一周后，血浆PS水平重新恢复。这些结果表明TPL抑制剂没有改变主要的菌群，它们可能通过影响小类菌群来减少PS的生成。

图5

本研究通过代谢组技术，发现肠道菌群来源的PS和DKD蛋白尿有高度关联。PS可增厚肾小球基底膜，引起足细胞线粒体功能障碍和血管周围纤维增生，对肾脏的多重毒性导致蛋白尿增加。因此，血浆高浓度PS的DKD患者可以降低PS浓度来防止蛋白尿发展。PS不仅仅是早期高危人群的诊断标志物，还是DKD治疗的潜在靶点。PS来源于食物中的酪氨酸，降低糖尿病的酪氨酸摄入可能减少PS的产生，从而减少蛋白尿，保护肾脏。此外，微生物TPL酶抑制剂可能是DKD药物的开发方向。

◆参考文献：

Koichi Kikuchi et al. Gut microbiome-derived phenyl sulfate contributes to albuminuria in diabetic kidney disease. Nature commuications,2019.