自然医学 | 肠道菌群和肠道FXR介导二甲双胍的临床疗效

1. 口服二甲双胍可调节T2D患者的肠道菌群和胆汁酸代谢

   为了研究口服二甲双胍如何控制人体肠道菌群群和代谢物，对22例T2D患者治疗前和经二甲双胍治疗3天后的血清、粪便样本进行了代谢组学分析，对粪便样本进行了宏基因组分析和临床指标关联研究。研究发现，二甲双胍治疗后肠道菌群组成发生了明显的变化（图1a），其中Bacteroides  finegoldii 和B. fragilis 是导致群体分离的最重要的2种菌群（图1b）。

   在拟杆菌属中，经二甲双胍处理后，多个物种的丰度均有所下降，其中B. fragilis的含量下降最为显著（图1c）。进一步使用代谢组技术对血清和粪便中胆汁酸水平进行了定量分析，二甲双胍治疗后，人体内GUDCA和TUDCA这两种结合的继发性胆汁酸水平显著升高（图1d）。

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2.GUDCA是一种FXR拮抗剂

    胆汁酸及其代谢产物是重要的生物活性配体，与肠道受体相互作用，调节代谢过程。在回肠远端，FXR被胆汁酸激活，诱导FGF19基因在人体内表达(Fgf15在小鼠体内表达)。经二甲双胍治疗后T2D患者的血清FGF19水平显著下降，7α-hydroxy-4-cholesten -3-one(C4)水平显著增加，表明肠道FXR信号被抑制，二甲双胍治疗后肝CYP7A1活动增加（图1e,f）。

     为了评价GUDCA和TUDCA是否为FXR的直接拮抗药，采用了TR-FRET FXR共激活剂实验。GUDCA和TUDCA均未表现出CDCA（一种FXR激动剂，阳性对照）的竞争性作用。在CDCA存在时，GUDCA和TUDCA是FXR的拮抗剂（图2a）。荧光素酶报告基因检测显示，GUDCA和TUDCA均明显抑制CDCA诱导的FXR转录活性（图2b）。在人肠道Caco-2细胞系中，CDCA对FXR靶基因SHP和FGF19 mRNAs的诱导作用被GUDCA和TUDCA明显抑制（图2c）。

     为了研究GUDCA和TUDCA在体内对FXR信号的抑制作用，对抗生素处理的微生物群衰竭小鼠给予TCA (FXR激动剂)联合CDCA、GUDCA和TUDCA灌胃。发现CDCA进一步提高了TCA诱导的肠道FXR信号，而GUDCA和TUDCA则减弱了TCA激活的肠道FXR信号（图2d）。这些结果表明，GUDCA和TUDCA是体内外潜在的FXR拮抗剂。

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3. 二甲双胍通过肠道菌群以AMPK独立的方式抑制肠道FXR信号

    FXR靶基因mRNAs在二甲双胍处理小鼠回肠中表达明显受抑制，但在肝脏中表达无明显变化（图2e）。二甲双胍治疗可上调肝细胞Cyp7a1 mRNA水平，其原因是肠道FXR-FGF15轴的下调（图2f）。为了确定肠道AMPK是否参与抑制肠道FXR的二甲双胍治疗,检测AMPKα 1和AMPKα 2在肠道中的水平，AMPKα 1作为肠道中AMPKα的主要形式，采用了肠道特异性的AMPKα 1敲除小鼠，发现AMPKα 1在肠道中的表达显著下降。在这个小鼠品系中，二甲双胍仍然减弱肠道FXR信号（图2g）。

    二甲双胍治疗抑制肠道FXR活化，但二甲双胍加抗生素组与抗生素组相比没有观察到FXR信号的进一步抑制（图2h）。在抗生素处理的微生物群衰竭小鼠中，二甲双胍对TCA激活的肠道FXR信号没有抑制作用，说明二甲双胍对肠道FXR信号的抑制依赖于微生物群（图2i）。结果表明，二甲双胍对肠道FXR信号的抑制作用依赖于肠道菌群，而非肠道AMPK。

4. B.fragilis与经二甲双胍治疗的T2D患者胆汁酸代谢产物和FXR信号的变化有

      为了鉴定T2D患者体内GUDCA和TUDCA代谢的细菌，评估了肠道菌群变化与胆汁酸之间的相关性。发现粪便和血清中的GUDCA和TUDCA仅与B.fragilis的存在呈负相关（图3a）。进一步分析肠道菌群变化与临床生化指标的相关性。B.fragilis的丰度与血清FGF19水平呈正相关，与血清C4水平呈负相关（图3b）。二甲双胍对B.fragilis的生长有直接的剂量依赖性抑制作用（图3c）。

    代谢组学分析表明，经二甲双胍处理后的B.fragilis的5-甲基-四氢叶酸水平高于对照组，B.fragilis中蛋氨酸含量较低（图3d,e）。补充蛋氨酸可恢复二甲双胍对B.fragilis生长的抑制作用（图3f）。为了阐明GUDCA和TUDCA的积累是否与二甲双胍抑制BSH活性有关，发现经二甲双胍处理后，B.fragilis Bsh基因拷贝数和BSH活性显著降低（图3g,h）。在二甲双胍处理过的B.fragilis中，GUDCA的去除率降低，但在使用BSH抑制剂咖啡酸苯乙酯(CAPE)处理时则没有显著降低（图3i）。

    此外，二氢叶酸还原酶抑制剂甲氧苄氨嘧啶(TMP)可以抑制B.fragilis介导的GUDCA水解（图3j）。在喂食HFD的小鼠中，补充TMP模拟二甲双胍对胆汁酸代谢和肠道FXR信号的影响（图3k,l）。这些结果表明，二甲双胍通过下调B.fragilis的BSH活性而上调GUDCA水平，主要是由于B.fragilis叶酸和蛋氨酸代谢紊乱所致。因此，二甲双胍对B.fragilis的调节可能导致肠道胆汁酸成分和FXR信号的改变。

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5. B. fragilis抑制二甲双胍对葡萄糖代谢的改善

     B.fragilis处理损害二甲双胍改善糖耐量和胰岛素敏感性（图4a-f）。二甲双胍增加的能量消耗经B.fragilis处理后大幅减少（图4g）。B.fragilis明显消除了TβMCA 和TUDCA的上调，降低了二甲双胍处理的小鼠肠道FXR信号（图4h,i）。B.fragilis可使经二甲双胍处理的小鼠sWAT（皮下白色脂肪组织）中致热基因mRNA水平增强（图4j），而eWAT（附睾白色脂肪组织）或BAT（棕色脂肪组织）中未出现此现象。

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6. 肠道FXR对二甲双胍诱导的代谢改善至关重要

    为了进一步解决肠道FXR在二甲双胍活动和评估作用的长期影响,发现二甲双胍抑制Fxr^fl/fl小鼠肠道FXR信号，限制体重再次增加，提高葡萄糖耐受和胰岛素敏感性，而对Fxr^ΔIE（FXR基因敲除）小鼠无影响（图5a-g）。二甲双胍大幅提升Fxr^fl/fl小鼠能量消耗，而对Fxr^ΔIE小鼠无影响（图5h）。在sWAT中，二甲双胍显著上调Fxr^fl/fl小鼠的热原基因表达水平，而Fxr^ΔIE小鼠对二甲双胍无反应（图5i）。免疫组织化学染色和免疫印迹分析证实了二甲双胍处理的Fxr^fl/fl小鼠的米色脂肪细胞生物源和UCP1表达水平增加，而在Fxr^fl/fl小鼠中未表现上调（图5j,k）。这些数据表明二甲双胍在改善依赖于肠道FXR信号的代谢疾病方面具有潜在的长期作用。

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7.GUDCA对葡萄糖耐受和胰岛素抵抗有治疗作用

    由于GUDCA是一种新型的FXR拮抗剂，因此进一步研究了GUDCA是否在体内产生代谢益处。口服GUDCA抑制肠道FXR信号，但不影响肝脏FXR信号（图6a）。胆汁酸谱分析显示，GUDCA和TUDCA水平明显升高，而其他胆汁酸代谢物未发生变化（图6b）。此外，GUDCA治疗对已建立的肥胖小鼠的代谢紊乱具有逆转作用（图6c-i）。GUDCA补充后血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平较低，说明无肝损伤。这些代谢改善与较高的代谢率是一致的（图6j）。此外，GUDCA显著提高了活性胰高血糖素样肽1 (GLP1)的产生，可能有助于改善葡萄糖稳态（图6k）。

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