直播回放｜韩贤林教授课程回顾

2021-05-19 17:52:27, 小迈武汉迈维代谢生物科技股份有限公司

4月14号，脂质组学创始人之一韩贤林教授给我们做了脂质组学的精彩讲解，没有看过瘾的小伙伴，福利来了，今天我们送上直播回放及ppt文字稿。

韩贤林教授直播完整录屏回放

今天我想讲的是脂质组学的基础内容——定性和定量。

脂质组学作为一门独立学科的研究已有近20年，2003年脂质组学的概念被首次提出，究其原因，涉及多个方面：脂质是一类非常重要的代谢产物，主要有三方面功能，即信号传递物、膜结构的组成部分、能量代谢的储藏物。除此之外，脂质还有很多功能，和糖、氨基酸一样，是细胞中不可缺少的一部分。

脂质的复杂性可以从多方面来讲，从分子水平上，脂肪链碳数目、双键位置和数目的不同，构成了五花八门的分子；不同的细胞膜、亚细胞上面的脂质组成不同；脂质代谢产物随着环境、身体健康、饮食等因素的变化而变化。而我们检测的是静态的、某一个时刻的脂质。

刚刚讲分子水平上的脂质到底复杂到什么程度呢？2005年发表了这样一篇文章：

这里把脂质归为八大类，大家感兴趣可以看一下，这是一篇非常经典的文章，可以了解到脂质的结构、命名以及它们相对应的功能。这八大类听上去好像很少，但拿glycerophospholipids简单举例，看一下这类脂质里面大概有多少个分子。

从Glycerophospholipids的通式结构上讲，中间是一个甘油，根据化学命名，3位上是一个磷酸二酯，1位和2位上是两根脂肪链，分子式比较简单。但这里面有三个变量，3位上的X是一个变量，1位和2位上的R1、R2是两个变量。正因为这三个变量，造成了一种比较复杂的状况，X可以是各种各样的极性小分子，如胆碱、一胺醇、甘油等，因此这些结构决定了脂质的分类。命名呢简略的写了用两种不同的命名方法，一般比较常见的文献里的是两个字母的命名，简单命名法，如胆碱的话是PC、PG、PE等。第2位上是脂肪酸的连接，根据脂肪链的碳数和双键数，大概有30种左右，碳数可以从14个碳变到22个碳。大家想一下，为什么没有2个碳到12个碳之间的脂肪链？因为这些脂肪链膜上比较少，极性也比较大，一般是水溶性的，含量也很少，所以如果分析过程中发现短链的位置，有很多很高量的短链脂肪链，一般来讲可能性是不大的。因此，要考虑一下分析的结果。一般来讲，细胞里面是14个碳变到22个碳左右，超过这个范围的脂质都很少。有些人说，我们可以检测到24个碳、26个碳这种脂肪链，有没有呢？肯定有，但相对来讲很微量。所以同样地，如果你的分析质谱里测到的24个碳、26个碳像PC、磷脂的量很高的话，可能你要自己给自己打一个问号？想办法去confirming一下。1位上更复杂一点，除了刚刚讲的那些脂肪链以外呢，还有三种链接方法在这个位置上面，第一种是烯醚键的形式连接的，氧的旁边直接接一个双键，这是非常重要的一类脂。第二种是直接接一个醚键，第三种是常见的酯的形式。这样算起来呢，第2位上大概有30种左右，1位上除了30种脂肪链还有三种不同的连接方法，所以整体加起来大概有100种左右。简单的估算一下，八大类里面，仅这一类，大概有3万种左右的峰值，实际上比3万种还要更多。对于这样复杂的体系来讲，20年代初的时候，随着质谱技术和其他组学的发展，相应地发展了脂质组学。

大家会经常问到一个问题，脂质属于代谢物，但已经有了代谢组学，为什么还要提出一个脂质组学？这里有几方面的考量，第一个是当时的代谢组学主要做的是水溶性的小分子，对于脂溶性的脂基本上没办法有效的分析，这是当时最大的一个局限性。第二个是分析方法上面完全准确的定量很少很少，现在逐渐多起来了。第三个是脂的样品制备方法完全不一样，因为大部分是脂溶性的，水相提取的话只有很少一部分脂会溶解。还有一个很重要的，在代谢网络里面，一个水溶性的小分子就占住了一个节点，而对脂类讲，每一个节点就对标一个class，可能是几百个几千个几万个这一类的脂。就是一个节点上不是一个分子，而是一个class，非常复杂。因此，当时绝大部分人认为脂质的研究与水相小分子比，有它的特殊性，应该建立它自己的方法。所以2003年，除了我们实验室提出了脂质组学以外，还有其他几个实验室也提出这么一个概念。

2002-2004年是这个学科发展起来的一个时间点。

脂质组学的分析流程和其他组学差不多，复杂性在于数据处理和样品制备方面，整理上来讲，大致分为三部分采样、检测、数据处理和解析。今天要讲的主要是第二部分。怎么样用质谱分析脂，主要涉及到定性和定量？定性和定量是一个非常复杂的课题，比如一个分子，检测到了M/Z，如果精度很高的话，根据M/Z可以进行判断。如果没有加常用的分裂分析，可以用MRM判断，大概有200多种分子；如果把连接的键是否有双键确定的话，大概有60种左右；如果把Fatty acyl两条支链定出来，大概有10种左右；如果这两条链位置也定出来了，大概5种左右；如果双键位置也定出来了，最后是一种。定性上来讲，可能会隐藏各种各样的同分异构体。唯一要解决的问题是结构的解析，如第一个位置的脂肪链是什么？第二个位置的脂肪链是什么？双键在什么位置？

为了做这个事情，我今天给大家介绍这么一个概念：

下面给大家举几个例子。所有PI基本都有三类特征峰，红颜色的是甘油，蓝色是磷酸根加上Inositol，橙色是两个脂肪链。掌握这个规律后就很容易从图铺上看出物质是哪一类并掌握其结构。下面这个是三酰甘油酯，三个特征峰三个甘油链。下面是PC类特征峰，和前面有一点不一样，这两个pattern分别是以脂或者醚的方式相连。这些patterns都在我这两本书里，此外还有不同脂质定量定性的问题。

做鉴定的时候一个class一个class要记住特征峰，而不是记一个个脂质特征峰。

鉴定到的物质不一定是细胞里存在的物质。在离子源里很容易产生碎片离子峰，碎片离子峰这个结果是非常不好的，这个是要尽量避免的。下面是PC带负电荷的谱图情况，可以看到丢掉了一个像氯仿一样的峰值。这个峰很容易产生是要避免的。不然鉴定结果很容易从PC类变成多两个碳原子的PE类了，而这已经有文献报道过了。此外还有PS变成PA类。还有三酰甘油酯在能量很高情况下变成二酰甘油酯。

脂质鉴定一定要满足生物背景，比如文献报道中含量低，而你做的含量高，这个就是有问题的。比如短链脂肪酸就比较少。

下面讲定量，为什么准确定量很重要呢？第一，就像前面提到的，代谢网络上这些物质并不是只有一个峰。只有测出所有的峰才能准确定量才能进行比较。所以从脂质定性上面来讲脂质定量非常重要。第二，17年有文献报道，nist1950在50家实验室脂质检测结果含量差别非常大五花八门。

第三，有各种不同的提意来解决定量问题。这是个比较有用的方法。比如有J.Lipid Res杂质明文规定脂质一定要有定量的数据，没有定量的数据不接收。

我们实验室很早就关注到这方面的问题，以准确定量为目标。这是我们写过的几篇文章，比如什么情况下需要内标，需要多少中内标等。我个人觉得这几篇文章很不错。

在质朴上离子强度和浓度间有这样一个线性关系I = ax + b。如果b值很小，那么这个公式就和光谱上的公式很相近。在这种情况下，加同位素内标，他们间的a是相同的。那么就可以用这样一个公式来计算，I_S/I_u = X_s/X_u。峰面积、电荷丰度也好跟浓度间的比值如此，通过同位素内标就可以计算未知的物质浓度。

问题是我们不可能采用这个多同位素内标来进行定量。如果没有同位素内标怎么办？是不是可以用同一类脂质内标来代替，这个代替要满足什么条件？下面将简单介绍一下这方面的情况。链的长短对电离、浓度对电离是否有干扰。

第二个浓度问题，浓度是脂质定量中非常关键的部分。一般而言，其他分析而言浓度越高，信号越强，但是对于脂质来说不是这样，为什么呢？因为脂质会形成各种各样的多聚体。那浓度高到什么深度会产生这个现象呢？这个取决于你的溶剂等各方面，特别是反相柱，因为其极性大，所以产生多聚体的几率非常大。反相柱能不用就不用。产生了多聚体要定量的可能性就不大了。