Science Advances：蛋白组学助力东南大学医学院刘必成教授团队进行IL-10细胞外囊泡法治疗缺血性AKI机制探究

急性肾损伤（AKI），一种肾功能的突然丧失，发病率和死亡率较高。此外，AKI经常增加患慢性肾脏病（CKD）和终末期肾脏疾病的风险。白介素10（IL-10）是一种功能强大的免疫调节剂，具有强大的抗炎和组织再生能力。在AKI中，研究表明IL-10可以通过限制炎症细胞因子的产生和免疫细胞浸润来预防缺血，顺铂或输尿管梗阻引起的肾脏损伤，表明IL-10可能是一种潜在的治疗方法。但是，细胞因子易受化学和物理不稳定因素的影响，并不可避免地激活循环中的白细胞，这可能导致患者受到伤害或降低治疗效果。解决问题的关键是如何提高IL-10的稳定性及靶向性。

细胞外囊泡（EVs），例如外泌体和微囊泡，是细胞以组成型或诱导型方式分泌的小膜颗粒（大小为40至1000 nm）。最近的研究表明，细胞外囊泡具有纳米载体进行药物输送的潜力。与现有的输送系统相比，细胞外囊泡的独特优势是其天然来源，这使它们能够逃避吞噬作用，延长治疗剂的半衰期并降低免疫原性。细胞外囊泡的脂质双层膜上装饰有可以与靶细胞相互作用的多种配体和受体，使其有望成为靶向递送的候选药物。因此，东南大学医学院刘必成教授研究团队在吉凯基因进行了液相色谱-串联质谱分析（LC-MS / MS），以IL-10 + EV的亲代细胞为对照评估其蛋白质组成。其发明了一种有效的方法，用于制备源自巨噬细胞的负载IL-10的EV（IL-10 + EV），并研究了IL-10 + EV在缺血性AKI鼠模型中的治疗效果。这种将细胞外囊泡用作IL-10的多功能递送系统，可作为治疗缺血性AKI的有效策略。

IL-10 + EVs的制备和表征：

为了开发IL-10 + EVs，将RAW 264.7巨噬细胞用编码鼠IL-10的质粒转染，并用地塞米松刺激以诱导M2c巨噬细胞表型，这是IL-10的主要来源。接下来，从上清液中分离出细胞外囊泡，并根据蛋白质标记，大小，形态和IL-10对其进行验证。用实验证明了设计的制备IL-10 + EVs的策略是可行和有效的，并确定了IL-10 + EVs具有较高的稳定性（图1）。

 图1

肾脏靶向IL-10 + EVs：

有针对性的IL-10方法可以改善其药代动力学性能并限制不良副作用。关于AKI的治疗，更具体地将IL-10靶向受损的肾脏应提供治疗益处。细胞外囊泡的脂质双层膜上有与靶细胞相互作用的多种配体和受体，使其有望成为靶向载体。在吉凯基因进行IL-10 + EVs的蛋白质组学分析，鉴定了1549种不同的蛋白质，其中367种与质膜有关。之后用一系列实验验证了IL-10 + EVs在体内和体外均表现出优先靶向受损肾脏的能力（图2）。

 图2

IL-10 + EVs功能：

为了评估IL-10 + EV的治疗效果，建立了肾脏I / R损伤的小鼠模型，并在再灌注后静脉内给予IL-10 + EVs。结果表明，IL-10 +细胞外囊泡可以减轻小鼠缺血性AKI，且在不同的实验模型中，IL-10 + EVs对AKI均具有治疗作用（图3）。

图3

IL-10 + EVs作用机制探究：

IL-10 + EVs抑制mTOR信号传导并诱导线粒体保持线粒体适应性，IL-10 + EVs通过诱导线粒体吞噬保持线粒体适应性来防止肾小管损伤（图4）。

图4

IL-10 + EVs诱发肾巨噬细胞转移：

通常，巨噬细胞是IL-10的主要靶细胞，它具有促进M2巨噬细胞极化的潜力，因此有助于组织修复。鉴于有I / R损伤的肾脏组织中巨噬细胞中积累了大量IL-10 + EVs，作者推测IL-10 + EVs可通过调节巨噬细胞表型来解决肾脏I / R损伤。结果表明，IL-10 + EVs可有效驱动M2巨噬细胞极化，从而抑制炎症并促进肾脏修复（图5）。

图5

IL-10 + EVs减弱AKI-CKD转变：

接下来，分析了IL-10 + EVs对AKI到CKD转变的影响。为了允许AKI后实验动物长期生存，采用了35分钟的温暖单侧IRI方法。结果表明，IL-10 + EVs可以中断AKI到CKD的进程（图6）。

图6

在这项研究中，刘教授团队报告了一种制造IL-10 + EVs的方法，并评估了IL-10 + EVs在治疗缺血性AKI中的可行性，安全性和有效性。IL-10 + EVs可抑制mTOR信号传导，从而促进线粒体代谢以维持TECs的线粒体适应性。此外，用IL-10 + EVs治疗可使巨噬细胞极化为M2型，以支持肾脏修复。此研究为缺血性AKI治疗中IL-10 + EVs的临床研究提供了新的见解，为后续IL-10+ EV的临床转化提供实验和理论依据。

在这篇文章中，刘教授团队的蛋白质组项目由吉凯基因协助完成。吉凯基因质谱平台技术实力与软硬件条件均处于同行领先水平。平台成立后专注于临床样本的分析检测，具备非常丰富的各类临床样本处理经验，在蛋白质组分析方法开发和数据挖掘上也有独特的专利和优势。目前吉凯基因已经在结直肠癌，肺癌等领域的biomarker和治疗靶标开发上走在了同行前列，并拥有完善的联合分析能力。针对药靶的磷酸化位点我们鉴定经验丰富，且具有交付周期短、免费联合分析、常规生信分析不限次数进行售后等优势。