学会这一招，CART高分文章不用愁！

这是今年1月在线发表于肿瘤核心期刊Clinical Cancer Research上的一篇CART在实体瘤领域的文章。

该文章是典型的以CAR框结构作为主要创新点的研究。

研究中选择的CART靶点和对应的scFV均已被报道，但是作者通过对CAR框进行了个性化改造，提升了文章的创新性。

这有点类似我们研究一些肿瘤基因，基因在所研究的肿瘤中已经被报道，但如果找到该基因的一个新的功能或机制方向，也可以发表在很不错的期刊上，CART研究领域也同样如此。

利用CART或者抗体药物靶向神经母细胞瘤中的GD2靶点之前已有研究。

作者在2017年也报道过用CART和PD-1抑制剂联合进行神经母细胞瘤的治疗，但是效果不太理想。其中一个很重要的原因在于，CART细胞在实体瘤治疗过程中静脉回输后受到的抗原刺激相对于血液瘤较少（实体瘤的抗原主要在瘤体中，相对于血液瘤而言，较难与CART接触到），导致CART细胞的激活和增殖维持时间较短，不能达到有效的杀伤。

这篇文章的思路很经典，即在CAR框上加入一个IL15的表达元件，使CART细胞可以同时高表达IL15，从而增强T细胞的激活和增殖（图1）。

图1

完整的T细胞激活来自三个层次的叠加：TCR介导的CD3激活、共刺激结构域的激活以及细胞因子介导的激活。

以往CART研究中用到的CAR框通常只包含前两个层次，即CD3激活和共刺激结构域，这两年越来越多的CART文章也会考虑加入第三个层次的激活，即细胞因子的激活，其中interleukin家族做得最多。本文即加入IL15作为细胞因子层面的刺激，以试图增强T细胞的激活和增殖，进而体内维持更长期的活化和杀伤。

我们再一起来看看这篇文章的数据结构——非常经典的CART研究：CAR病毒构建-CART细胞制备-CART细胞体外功能及体内功能验证。每一部分的实验都很经典，做CART研究的老师可以作为参考。

首先，作者构建了可以同时表达IL-15和GD2-CAR的CART细胞（选择CD28的经典二代框），发现和单独表达GD2-CAR的CART细胞相比，CART细胞的转染效率和扩增能力没有受到明显影响，两者比较接近。

接着，作者检测制备的CART细胞里中心记忆T细胞(CD45RO+CCR7+)以及初生T细胞 (CD45RA+CCR7+)的比例，发现这两种T细胞亚型的比例在GD2.CAR.IL15组中有显著提高，且PD1阳性的T细胞比例减少，提示这种新CAR框制备的T细胞可能具有更好的增殖潜力以及抵抗PD-L1介导的免疫抑制（图1）。

现在的CART研究中，除了CD4，CD8，CD3这些经典的T细胞marker会检测外，T细胞亚型的marker也会一起检测，其中T细胞激活marker，中心记忆T细胞marker，初生T细胞marker，免疫耗竭marker检测得最多。

接下来作者进行了CART细胞的体外功能学验证（图2）。

图2

首先是验证直接杀伤靶细胞能力，在4株NB细胞系里，GD2. CART.IL15和GD2.CART在效靶比1：1时，均能完全杀伤肿瘤细胞，但GD2. CART.IL15增殖能力和细胞因子释放程度要强于GD2.CART，作者没有给出效靶比更低时的杀伤情况，1：1的时候肿瘤细胞均完全死亡，看不出差别。

一般这种情况可以通过多设置一些效靶比梯度或者进行多轮靶细胞重复刺激来扩大差异，本文选择了第二种方式。

在多轮共培养后，GD2. CART.IL15展现出了明显强于GD2.CART的杀伤效果，增殖能力，细胞因子释放水平，且PD-1的表达阳性的CART细胞比例也相对更低。

作者进行了多种体内实验的功能验证，通过对NSG小鼠进行尾静脉注射NB细胞建立NB转移瘤模型，尾静脉回输1x107CART细胞后发现，GD2. CART.IL15和GD2.CART两者相对于未转染T细胞，均表现出对肿瘤的完全抑制。

通过将回输量降低到5x10⁶及2x10⁶后发现，GD2.CAR.IL15 T细胞在低回输量时仍能保持对肿瘤细胞的完全抑制，而GD2.CAR T细胞在回输后21天则肿瘤出现复发(图3)。

图3

通常体内实验除了通过设置多个回输量扩大差异外，也可以进行肿瘤二次回输（rechallenge）来进一步确认CART细胞在体内长期杀伤能力（短期杀伤可能看不出差异）。

在CART细胞回输后第7天以及第14天再次进行尾静脉注射NB细胞系（图4）

图4

可以发现GD2.CAR.IL15 T细胞对于新注射的肿瘤细胞仍然保持高度的抑制，可以维持到55天，而GD2.CART细胞只能维持到21天即出现转移瘤，且在血液、骨髓、脾脏、肝脏中也发现了更多比例的GD2.CAR.IL15 T细胞，表明GD2.CAR.IL15 T细胞在体内的增殖能力有显著提高。

作者随后检测回输后CART细胞中PD1+阳性T细胞的比例，发现GD2.CAR.IL15 T细胞中PD1+阳性比例相对于GD2.CART细胞中比例更少，通过联用PD-1抑制剂以及选用PD-L1高表达NB细胞系进行体内杀伤实验，发现两种CART细胞的杀伤能力受益会有所不同，PD1+阳性比例较低的GD2.CAR.IL15 T细胞组受益更少，但能提升GD2.CART 细胞的杀伤能力。

由于IL15在GD2.CAR.IL15 T细胞中的持续表达增加了CART细胞在体内的长期增殖和杀伤肿瘤能力，但这同时也可能会带来潜在的细胞毒性，因而作者通过载体改造在GD2.CAR.IL15基础上加上了目前CART研究中常用到的caspase9诱导表达元件IC9（IC9.GD2.CAR.IL15），以增加对回输后CART细胞数量的控制。

通过优化载体结构后，作者成功实现了同时在T细胞上表达GD2-CAR。IL15，IC9，体外及体内杀伤实验发现IC9.GD2.CAR.IL15与GD2.CAR.IL15杀伤能力没有显著差异，rechallenge实验显示IC9.GD2.CAR.IL15仍具有长期抑制效果，表明IC9元件的增加没有影响到GD2.CAR.IL15病毒结构本身的表达效力以及CART细胞的功能（图5）。

图5

最后通过直接尾静脉回输表达luciferase的IC9.GD2.CAR.IL15 T细胞后，加入IC9诱导剂CID后，可以消除绝大部分血液、骨髓、肝脏、脾脏中的IC9.GD2.CAR.IL15 T细胞，后续进行肿瘤细胞的rechallenge，也不会再刺激IC9.GD2.CAR.IL15 T细胞的增殖，表明这种CART细胞可以被成功的诱导清除（图6）。

图6

这篇文章的核心创新点是——从现有的二代CD28框中加入了一个额外IL15表达元件，从而使CART细胞在体内具有更长期的增殖和杀伤效力。

尽管IL15以及interleukin家族蛋白作为元件在CART研究领域已有不少研究，但是在胶质母细胞瘤中这篇文章首次验证了其可行性，加上体内验证做得比较完善，因此能够发表在CCR上。

目前CART研究的文章创新点主要在于CAR框上的各个元件，不管是针对scFV还是共刺激结构域做一些创新（针对同一个抗原选择一条新的scFV或者更换共刺激结构域），或是与这篇文章一样，增加一些额外的表达元件，只要CAR框有变动有一定创新，发表高分文章的机会便大了很多。

后续的体外和体内功能验证基本上都是固定的经典实验，通常包括抗原和SCFV筛选、CAR病毒载体构建、T细胞转染、靶细胞表面抗原验证、CAR-T细胞体外体内杀伤能力和增殖能力检测等内容。

吉凯基因以“CAR-T细胞免疫治疗技术”的临床转化为目标，可提供抗原筛选验证、CAR-T细胞制备（包含scFV筛选，CAR慢病毒构建及T细胞分离转染）、临床前体外体内验证实验的一站式科研服务，后期可为临床转化提供专利申请和相关技术支持，欢迎各位老师垂询。

【参考文献】

Yuhui Chen, Chuang Sun et.al. Eradication of neuroblastoma by T cells redirected with an optimized GD2-specific chimeric antigen receptor and interleukin-15. Clinical Cancer Research. 2019 May 1;25(9):2915-2924

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