项目文章 | 安徽农大运用LC-MS代谢组学和GC-MS代谢组学对茶树细胞代谢效应研究

2019年7月欧易/鹿明生物合作客户安徽农业大学侯如燕教授课题组在J.Agric.Food Chem发表了题为“Thiamethoxam metabolism and metabolic effects in cell suspension culture of tea (Camellia sinensis L.)”的研究成果，通过GC-MS代谢组学和LC-MS代谢组学研究方法，预测所涉及的酶以及TMX生物降解的机制，本研究对茶树细胞中参与TMX代谢的酶提供了指导，并进一步加深了我们对茶叶与农药TMX相互作用的认识。

作者在之前的研究表明，与吡虫啉、啶虫脒和吡虫啉这三种新烟碱类物质相比，TMX在茶叶细胞悬浮培养中更容易代谢，并在培养物中鉴定出七种代谢产物，包括另一种常用的杀虫剂克洛替啶（CLO），但TMX对悬浮培养茶叶细胞代谢的影响及其代谢机制尚不清楚。代谢组学方法可以同时测量多个终点，其可以揭示任何受影响的代谢途径。这种方法可以揭示农药与植物之间的相互作用。

在此，作者使用非靶向代谢组学方法来研究TMX处理后的代谢扰动，目的是预测所涉及的酶以及TMX生物降解的机制。在我们之前的研究中，发现几乎TMX的所有代谢产物都被排泄到茶叶细胞的悬浮培养中。因此，我们分析了茶叶细胞和培养上清的代谢变化。这些数据为进一步研究茶树细胞中参与TMX代谢的酶提供了指导，并进一步加深了我们对茶叶与农药TMX相互作用的认识。

1. TMX在茶叶细胞悬浮培养中的作用

在之前的研究中，从用TMX处理的茶细胞悬浮培养物中，共检测到7种TMX代谢物，如通过切割TMX的恶二嗪环而产生的CLO。这些结果表明，农药代谢相对缓慢，可能是由于细胞内的农药胁迫所致。因此，在进行代谢组学实验之前，作者研究了不同浓度（0.5、5.0和mg·L^-1）的茶细胞悬浮培养液中TMX的代谢过程。计算了代谢率，结果表明TMX对茶细胞悬浮培养中自身代谢有剂量效应：化合物浓度越高，农药代谢越慢（图1）。这可能是因为杀虫剂抑制了培养的茶细胞的正常生长。随着时间的推移，代谢TMX比例的差异变得剧烈，特别是在45d之后。在第45天，23.8%的TMX在0.5mg·L^-1TMX处理的细胞中代谢，但在50mg·L^-1处理的细胞中代谢不明显。在此基础上，采用0.5mg·L^-1的TMX剂量处理茶培养物进行代谢组学实验，并将采样时间设为第45天。

图1 | 不同浓度TMX处理的茶细胞悬浮培养中噻虫嗪随时间的累积降解情况

2. 比较TMX处理与不处理茶叶悬浮细胞代谢产物

一共从未处理和处理的茶叶细胞中检测到9007个代谢物，其中用GC-MS代谢组学鉴定到447个代谢物，LC-MS代谢组学鉴定到8560个代谢物。碳水化合物、氨基酸、有机酸等是主要代谢产物。

进行了PCA和OPLS-DA分析（图2），根据PCA和OPLS-DA数据，未处理和处理的样品有明显的差异（图2a）。GC-MS代谢组学数据的主成分分析图表明，前两个坐标轴解释了未处理细胞和处理细胞之间的差异的28.1%和19.1%（图2a1）。LC-MS代谢组学数据的PCA图的前两个分量分别占差异的27.9%和15.8%（图2a3）。200个响应置换试验的R2和Q2值，GC-MS代谢组学数据分别为0.969和-0.098，LC-MS代谢组学数据分别为0.902和-0.204。结果表明，用OPLS-DA模型计算的数据是可靠的。

图2 | GC-MS和LC-MS检测茶细胞悬浮培养中代谢产物的分析结果

使用OPLS-DA数据，可以看到“S”图（图3a和3b）。远离轴心的代谢物在对照组和TMX处理组之间显著变化。GC-MS（60）和LC-MS（175）共检测到235种不同的代谢产物（VIP>1，p<0.05）。与未经处理的对照组相比，处理样品中的代谢物上调（37种来自GC-MS，76种来自LC-MS数据）或下调（23种来自GC-MS，99种来自LC-MS） 。不同的化合物被确定为核苷、氨基酸、脂类、有机酸、脂肪酸、糖和多元醇。

在GC-MS代谢组学分析中，TMX处理显著增加了葡萄糖-6-磷酸、异柠檬酸和鸟苷，而TMX处理显著降低了4-氨基丁酸（GABA）、蔗糖、谷胱甘肽-H2O、富马酸和腺嘌呤。与LC-MS代谢组学分析结果相比，TMX处理显著提高了PC（磷脂酰胆碱，15:0/17:2（9Z，12Z））、PE（磷脂酰乙醇胺，15:0/18:1（11Z））和PC（18:0/18:1（11Z）），而腺苷，4-羟基-2，TMX处理显著降低了6-二甲基苯胺和丙烯酸的含量。

图3 | 茶细胞和悬浮液经TMX处理后代谢产物的S-plot图分析

4.通路分析

利用KEGG数据库分析了TMX干扰代谢产物的相关生物途径。通过绘制经TMX处理富集的代谢物（经GG-MS和LC-MS鉴定）的图谱，确定了受TMX处理影响的代谢通路（表1）。在细胞内，TMX处理与对照之间的显著变化途径包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢；TCA循环；嘌呤代谢；甘油脂代谢和嘧啶代谢。在培养上清液中，对照组和TMX组半乳糖代谢、甘油脂代谢、烟酸和烟酰胺代谢、苯丙氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、甘油磷脂代谢和鞘脂代谢均发生显著变化。上清液中化合物的变化受细胞代谢变化的影响。

图4 | 茶细胞悬浮培养液和茶细胞悬浮培养液中不同代谢物富集的代谢通路

5.分子对接

用MOE配体相互作用分析模拟TMX或其代谢物与TMX处理的茶叶细胞悬浮培养物中与干扰KEGG途径相关的酶的结合（图5）。3''(2''), 5''-二磷酸核苷酸酶对TMX处理有反应。在建模时，通过接受两个H-键，预计TMX（图5a）与氨基酸活性位点具有6.0432 kcal mol-1结合亲和力。一个是TMX中3位的O和3''(2''), 5''-二磷酸核苷酸酶中的Thr195之间的H键，另一个是TMX中的噻唑环和His198之间的H键。TMX代谢物N-（2-氯-噻唑-5-基甲基）-胍（图5b）与4-氨基丁酸转氨酶的氨基酸活性位点具有10.1286 kcal mol-1的结合亲和力。胍加合物被模拟成接受四个H-键，一个S位于1位，Lys442位于4-氨基丁酸转氨酶中，另外三个位于胍基和Lys442之间。这些结果对TMX代谢和细胞间相互作用的研究具有启发意义。

图5 | 农药与酶之间的分子和配体相互作用图谱

1.TMX对糖代谢的影响

本报告是一项新的研究，使用非靶向代谢组学策略来研究经杀虫剂TMX处理的茶细胞悬浮培养物的整体代谢变化。关于农药在植物细胞中的去向的研究比关于农药在动物体内代谢的研究少。在这几项研究中，大多数只确定了细胞中农药的代谢物，而对总代谢扰动、鉴定农药代谢可能涉及的途径和酶或鉴定受农药影响的代谢途径的研究甚少。以前的一些研究表明，农药代谢产物在动植物中往往是相似或相同的，这意味着相同或相似的酶在动植物中催化相似的生物转化反应。

研究表明，TMX主要通过下调α-淀粉酶和葡萄糖脱氢酶等酶的基因来降低蜜蜂体内的碳水化合物代谢和能量供应。研究发现，TMX确实通过糖酵解、TCA循环和半乳糖代谢等途径影响糖的代谢。上调的物质包括异柠檬酸、葡萄糖-6-磷酸、木糖、乳果糖、棉子糖、甘露糖和褪黑糖。下调物质为富马酸、蔗糖和腭糖。葡萄糖代谢是细胞内主要的能量反应之一，因此TMX对葡萄糖产生的影响是值得注意的。结果表明，茶细胞对TMX处理的反应是蔗糖代谢加速，导致蔗糖水平下降。葡萄糖脱氢酶的降低会降低细胞对葡萄糖-6-磷酸的代谢，导致观察到的葡萄糖-6-磷酸的数量增加。以上结果表明，TMX对茶细胞悬浮培养物中糖代谢有抑制作用。

2.TMX对氨基酸代谢的影响

细胞内最重要的代谢途径是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸途径。TMX的加入显著影响氨基酸代谢。在该途径的代谢产物中，GABA降低。在植物中，GABA与碳、氮代谢有关，在不同环境下激活防御机制。在使用杀虫剂混合物处理24小时后，水稻显著下调GABA，与作者的结果一致。代谢组学研究还表明，TMX处理能显著降低茶细胞悬浮液中谷胱甘肽-H2O的含量。TMX处理提高了酶3''(2''), 5''-二磷酸核苷酸酶的水平，从而促进了硫和谷胱甘肽的代谢。由于在我们的研究中谷胱甘肽-H2O[P1] 的量减少了，并且TMX可映射到3''(2''), 5''-二磷酸核苷酸酶的结构，因此推测在作者的实验中，该酶的量也增加了。

3.TMX与细胞代谢的相互作用

农药的毒性不仅是由于所使用的活性成分，而且是由于与目标害虫或其寄主植物中自然产生的酶直接相互作用而产生的代谢物。本研究采用LC-MS代谢组学和GC-MS代谢组学方法，研究了TMX对茶叶细胞以及对茶叶细胞悬浮培养的影响。根据KEGG数据库分析代谢途径的变化，并预测与TMX治疗相关的酶的变化。利用分子模拟方法进一步验证任何已鉴定的酶的参与度表明，3''(2''), 5''-二磷酸核苷酸酶可与TMX相互作用，4-氨基丁酸转氨酶可将TMX中的鸟苷基转化为羧基。应使用分子方法对任何已鉴定的酶的参与进行功能验证，以显示改变的表达和蛋白质含量（上调）。以这种方式，TMX代谢背后的特殊机制需要使用转录组学和蛋白质组学等工具进行额外的研究。本研究为研究农药与植物的相互作用提供了理论依据。

噻虫嗪(TMX)除具有杀虫活性外，已在植物组织或细胞中被证实具有生理作用。本文作者用LC-MS非靶向代谢组学和GC-MS非靶向代谢组学方法研究了45天的茶树细胞悬浮培养物对茶树细胞和培养上清的代谢影响。采用多因素分析(PCA和OPLS-DA)，所有治疗组和对照组可以明确区分。在细胞内，与未处理的细胞相比，有113个代谢物表达上调，122个代谢物表达下调。在培养上清液中，与未处理的培养相比，有128个上调和35个下调的代谢物。KEGG检索结果显示，茶叶细胞内的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径受到TMX代谢的强烈影响。分子对接模型显示， 4-氨基丁酸氨基转移酶可能与2-氯噻唑-5-羧酸的形成有关，3''(2'')、5''-二磷酸核苷酸可能与TMX相互作用。本研究有助于了解农药与植物细胞的相互作用机制。

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