项目文章 | 恭喜中国农科院麻类所彭源德研究员团队谢纯良老师等新发灵芝非靶向代谢组学研究成果

2020年5月欧易/鹿明生物合作客户中国农业科学院彭源德研究员课题组在LWT - Food Science and Technology发表了题为 “Mapping the metabolic signatures of fermentation broth, mycelium, fruiting body and spores powder from Ganoderma lucidum by untargeted metabolomics ”的研究成果，通过非靶向代谢组学研究手段，研究提供了灵芝不同部分，尤其是发酵液的整体代谢态势的全面描述。本研究为灵芝的质量评价和综合利用提供了理论依据。

灵芝（G. lucidum）是一种在中国广泛使用的药用蘑菇。在市场对灵芝的发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉的使用是分开的。但是，对于灵芝不同用法的分子基础没有全面的见解来阐明。为了解决这一问题，本文基于非靶向质谱的代谢组学方法获得发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉的代谢特征，从而为灵芝不同部分的独特使用提供分子基础。

1.灵芝不同部分代谢产物

灵芝发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉具有不同的生理功能和不同的用法。通过LC-ESI-Q-TOF应用非靶向代谢组学分析这四个不同部分的代谢变化。经过峰提取和匹配后，从数据预处理中总共提取了8086、8038、9384和8229个独特的代谢物（包括多糖，核苷，肽，三萜类和生物碱），并分别定量了发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉。在四个不同部分之间检测到的代谢物谱有相当大的重叠。但是，发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉特有的成分分别为48、25、364和28（图1）。与灵芝的其他三个部分相比，子实体具有更多的独特特征。此外，孢子粉和子实体具有更多的共同特征。这四个部分特有的代谢物可以作为区分灵芝不同部分的线索。

图1 | 灵芝不同部分检测到的代谢物特征的维恩图

2. PCA和OPLS-DA显示灵芝不同部分的不同代谢物

PCA的统计评估表明，来自发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉的样品位于该图的不同区域，这表明每个部分都有不同的代谢产物（图2）。为了排除可能的混淆变量并评估信号的统计意义，采用监督的OPLS-DA模型分析发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉之间的差异。

图2 | PCA图显示了灵芝不同部分独特代谢组

图3显示了发酵液与其他样品之间的良好分离，表明不同样品的代谢物之间存在显著差异。为了更多地了解发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉之间的代谢物发生显著变化，将具有VIP>1，P<0.05和FC>2的特征鉴定为差异表达的代谢物。这些代谢产物包括多糖，三萜类化合物，核苷和生物碱，可作为发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉等的判别物质。

图3 | OPLS-DA得分图显示灵芝不同部分的分离

3.灵芝不同部分三萜类化合物代谢特征

三萜类化合物是灵芝中主要的次级代谢产物，尤其是灵芝酸（GAs），据报道具有抗炎，抗肿瘤，抗HIV，神经保护和降血脂活性。在发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉中分别鉴定出33种，36种，40种和38种三萜。这些三萜类化合物在四个灵芝样品中的表达水平不同。其中，与菌丝体，孢子粉和子实体相比，发酵液中灵芝酸β的表达上调。菌丝体中的丹芝酸C和赤芝酸D1，E2，K均被上调。孢子粉中的灵芝酸Mf，Mg和灵芝醇C被上调。最重要的是，子实体中三萜的种类和含量最丰富。灵芝稀酸A，B，D，E，灵芝酸A，C2，D，M，ε，F，G，H，I，L，S，V，灵芝醇C，F，H，I，灵芝酸TQ，灵芝甾酮，子实体中丹芝酸B，E，鸟苷酸和赤芝酸B，D2，G，J，N均上调。该研究显示了发酵液中三萜类化合物的全面概况。此外，该研究发现发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉具有不同的三萜类成分和含量。根据化合物功能信息，建议子实体可以特别用作抗肿瘤和抗艾滋病药物。（图4）

图4 | 灵芝不同部分三萜类化合物热图

4.灵芝不同部分多糖和核苷类化合物代谢特征

灵芝多糖是主要的生物活性成分，具有抗癌，抗炎，抗氧化，免疫调节，降血脂和抗微生物活性。在本研究中，分别在发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉中鉴定出30、31、32和29种多糖（图5）。在发酵液中果糖，葡萄糖，木糖，D-甘露糖和D-吡喃葡萄糖等15种多糖上调。8种多糖，包括1-O-caffeoyl(b-D-glucose 6-O-sulfate)，1-(3-methyl-2-butenoyl)-6-apiosylglucose，1[(5-amino-5-carboxypentyl)amino]-1-deoxyfructose，6-磷酸甘露糖，UDP-D-木糖，蔗糖单硬脂酸酯，UDP-4-dehydro-6-deoxy-Dglucose，尿苷和UDP-葡萄糖在菌丝体中上调。此外，(E)-1-O-cinnamoyl-beta-D-glucose，1-(3-methylbutanoyl)-6-apiosylglucose，1-O-E-cinnamoyl-(6-arabinosylglucose)，2-Oa-L-fucopyranosyl-galactose，sucrose monopalmitate和蔗糖硬脂酸酯被上调。此外，还包括1-Ocaffeoyl-(b-D-glucose 6-O-sulfate)，D-木糖，fucose 1-phosphate，1-O-pcoumaroyl-(b-D-glucose 6-O-sulfate)，galactose-beta-1,4-xylose，UDP-4dehydro-6-deoxy-D-glucose，麦芽糖和UDP-D-galactose(2-)被上调。该结果表明灵芝的不同部分具有独特的多糖组成，这将为规范灵芝多糖的质量提供理论参考。据报道，核苷可调节核酸的合成，增强免疫反应，帮助铁的吸收并影响脂肪酸的代谢。在本研究中，尿苷在菌丝体中被上调。

图5 | 灵芝不同部分多糖和核苷类化合物热图

5.灵芝不同部分生物碱类化合物代谢特征

生物碱对高血压，高脂血症，心血管和脑血管疾病，肌无力和肝炎有一定的治疗作用。在本研究中，在发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉中分别鉴定出29、30、33和33种生物碱。发现Alpha-Linoleoylcholine，heptanoyl choline和succinyl monocholine在发酵液中被上调。在菌丝体中上调了三种glycerophosphocholines，(4-Hydroxybenzoyl)choline，caproylcholine，decanoylcholine，lactyltrimethyl ammoniumbetaine，sphingosine-1-phosphocholine和undecanoylcholine。在子实体中，五种甘油磷酸胆碱，9-decenoylcholine，alpha-cinoleoylcholine，caproylcholine，胆碱，feruloylcholine和磷酸胆碱被上调。孢子粉中的三种glycerophosphocholines，砷甜菜碱，甜菜碱，heptanoylcholine，lactyltrimethyl ammonium betaine和proline betaine被上调（图6）。具体而言，胆碱的表达在发酵液，菌丝体，子实体中主要不同，而甜菜碱则更多地存在于孢子粉中（图6）。本研究首次给出了灵芝胆碱的详细分布图，根据物质功能信息，可为心血管和神经系统疾病的治疗提供参考。此外，五种甜菜碱在孢子粉中特别上调，表明孢子粉可用于开发治疗肝病和糖尿病的药物。

图6 | 灵芝不同部分生物碱类化合物热图

6.灵芝不同部分之间的主要差异代谢途径

由于其独特的发酵和代谢作用，灵芝中的氨基酸分解代谢途径在发酵液，菌丝体，子实体和孢子粉显著不同。L-色氨酸，精氨酸和脯氨酸的代谢主要在发酵液中上调。菌丝体内的丙氨酸，天门冬氨酸和谷氨酸代谢被上调。根据化合物功能信息，发酵液和菌丝体可能用作氨基酸膳食补充剂。由于不同的氨基酸组成，灵芝的不同部分具有各种生理活性。

图7 | KEGG途径中差异表达代谢物的富集

7.灵芝不同部分之间的代谢物相关性分析

这四个部分组合的代谢物-代谢物相关性显示出独特的特征。在三萜类化合物中，灵芝稀酸A，B，D，E，灵芝酸A，C2，DM，ε，F，G，H，L，S，V，MJ，灵芝醇F，H，I，灵芝酸TQ，Ganodosterone，丹芝酸B，E，鸟苷酸和赤芝酸B，D2，J，N，M与其他代谢物相比，具有正相关性，这表明这些三萜可以用作区分子实体的生物标记；与其他代谢物相比，灵芝酸Mf，Mg，灵芝醇C，赤芝酸G具有负相关性（图4）。在多糖组中，图5显示总共35种代谢物具有显著的相关性，其中29种具有正相关性，5种具有负相关性。与其他代谢物相比，Galactose-beta-1,4-xylose，Mannose 6-phosphate，UDP-4-dehydro-6-deoxy-D-glucose和UDP-D-galactose(2-)具有负相关性。在生物碱组中，共有45种代谢产物具有显著相关性，其中22种为阳性，18种为阴性（图6）。甜菜碱,1-(8-[5]ladderane-octanoyl)-2-(8-[3]-ladderane-octanyl)-sn-glycerophosphocholine，Proline betaine和1-(6-[5]-ladderane-hexanoyl)-2-(8[3]-ladderane-octanyl)-sn-glycerophosphocholine与其它代谢物相比具有正相关性。这些结果表明，具有正相关性的代谢物可以用作区分灵芝不同部分的潜在标记化合物。

这项研究运用提供了灵芝不同部分，尤其是发酵液的整体代谢态势的全面描述，这将在分子水平上促进灵芝不同部分的功能和药效。根据非靶向代谢组学的结果，可以得出以下结论：子实体可以特别用作抗肿瘤和抗艾滋病药物；孢子粉可用于开发治疗肝病和糖尿病的药物；灵芝的四个部分可用于抗氧化剂领域。本研究为灵芝的质量评价和综合利用提供了理论依据。

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Kushi Jean  撰文

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