项目文章 | 接踵而来，西南科技大学罗学刚团队再发多组学植物铀毒性机制成果

继2019年10月，欧易/鹿明生物合作客户西南科技大学环境与资源学院罗学刚教授团队在一区期刊Journal of Hazardous Materials（IF=7.650）发表题为“植物铀毒性机制的代谢、转录组分析和矿物质营养代谢研究”的文章之后。点击查看【多组学深度解读】客户文章 | 西南科技大学运用多层组学整合分析对植物铀毒性机制研究。

罗教授团队针对数据的深入挖掘，2020年5月研究成果又喜登此刊。发表了题为“Unraveling response mechanism of photosynthetic metabolism and respiratory metabolism to uranium-exposure in Vicia faba”的研究文章，通过转录组学和GC-MS非靶向代谢组学结合植物生理参数分析等研究手段，发现放射性元素铀对植物生长和根系微观结构的影响，深入而透彻地阐明了铀暴露对植物光合碳代谢和呼吸代谢的毒性机制。

铀（U）是一种天然放射性核素，因其半衰期长，化学毒性的危险性高于放射毒性。铀被有机体摄入时具有持久的化学毒性，例如植物毒性。目前关于铀植物毒性研究主要集中在植物对铀毒性的生理反应上，关于转录组学、蛋白质组学和代谢组学水平上对铀毒性的反应机制的报道很少。之前的研究中，作者报道了铀的植物毒性机制之一是高铀暴露导致植物矿物质中营养代谢的失衡和植物激素信号传导途径的功能失调。在本研究中，作者使用了先前报道的转录组、代谢组数据并结合植物生理学分析进一步阐明了植物铀暴露对光合碳代谢和呼吸代谢的毒性机制。

1.实验材料

使用硝酸铀酰（238U，UO₂（NO₃）₂·6H₂O）做铀源，在其它条件相同但铀浓度不同的情况下，处理蚕豆幼苗（发芽14天）72小时。同时在叶子上喷洒磷酸盐溶液（KH₂PO₄，0.1 mM）以防止植物出现磷缺乏的症状。铀浓度分别为0（对照），5、10、15、20和25μM /L。           

2.表型与元素分析

植物生长：测量根长、根直径和根体积；

根微观结构：扫描电子显微镜（SEM）；

元素种类：能量色散谱仪（EDS）；

铀积累：根干燥并压碎（100目过筛），X射线荧光（XRF）分析U积累；

3.生理参数分析

光合参数分析：光合速率、气孔导度、细胞间CO₂浓度和蒸腾速率；

叶绿素含量：分光光度计分别在645nm和663nm波长处测量；

糖含量：酚比色法测定根的总糖含量；

根部呼吸速率：非扩散红外（NDIR）光吸收方法分析根部呼吸速率；

磷含量：钼酸铵分光光度法；

4.多组学分析

（1）非靶向代谢轮廓分析

选择对照组（0μM /L）和高浓度铀（25μM /L）处理组的植物根，进行GC-MS非靶向分析，每组6次生物学重复。

（2）转录组测序分析

选择对照组（0μM /L）和高浓度铀（25μM /L）处理组的植物根进行RNA测序，每组3次生物学重复。

1.铀对植物生长和根系微结构的影响

高浓度U对幼苗具有显著的植物毒性（图1A-F），且随着U浓度的增加（0-25μM）根发黑且损害程度明显增加。SEM结果表明，不同的U处理显著改变根的表面微观结构。EDS光谱证实，当U浓度超过10μM时在根细胞中积累。

图1 | 铀暴露对蚕豆生长和根微结构的影响

XRF分析结果表明U积累量达到225.5-6250.94 mg/kg（图2A）。当U浓度为10–25μM时，幼苗的总根长、根直径和总根体积显著减少（图2B-D）。

图2 | X射线荧光光谱法分析根中的铀积累及其对根的毒性作用

2. 铀对光合作用，呼吸和磷含量的影响

如图3所示，幼苗的光合作用参数（光合速率[A]，气孔导度[Gs]和气孔导度[E]）随U浓度（0至25μM）的增加而显著降低，但对叶片细胞间CO₂（Ci）参数不明显。当U浓度为5μM至25μM时，叶绿素a和叶绿素b的含量没有显著差异（图3E和F）。根中总糖含量和呼吸速率随U浓度的升高而逐渐降低（图3G和H）。此外，U抑制了根部的P含量（图3I）。这些结果表明，植物中U积累导致蚕豆幼苗光合碳代谢和呼吸代谢异常。

图3 | 蚕豆光合作用参数、根系呼吸速率、可溶性糖和磷含量对铀暴露的响应

3. 铀暴露对根代谢谱的影响

非靶向GC-MS代谢组学分析中，总共鉴定出184种代谢物。使用PCA和OPLS-DA多元统计分析方法筛选了两组样品（0和25μM）中的不同代谢物。根据OPLS-DA模型变量中的VIP，鉴定出68种差异表达的代谢产（DEM），包括26种上调和42种下调的代谢产物（VIP> 1和P <0.05）（图4C）。将DEM映射到KEGG代谢途径数据库，发现富集的途径主要涉及碳水化合物代谢、氨基酸生物合成和次级代谢产物代谢的过程（图4D）。

图4 | 铀处理下蚕豆根系代谢特征

4.铀暴露对碳水化合物代谢的影响

非靶向代谢组学分析中总共检测到53种与碳水化合物代谢相关的代谢物，其中鉴定出25种DEM，包括13种显著上调和12种显著下调的代谢物。PCA分析中的负荷图显示，U暴露显着改变了碳水化合物代谢途径的代谢模式（图5A），结果显示酪氨酸、丙酮酸和半乳糖醇下调，同时葡萄糖、果糖和塔格糖的表达上调（图5B和C）。这些结果表明U导致植物碳水化合物代谢物失衡。

图5 | 铀对蚕豆根系碳水化合物代谢途径

5.铀暴露下细胞和主要代谢反应

通过RNA测序分析筛选了3,213个DEG（图6A），包括961个上调的基因和2,252个下调的基因。在U暴露下根细胞中的生物/非生物胁迫响应、氧化还原、细胞分裂、细胞周期和发育基因对U毒性具有显著响应（图6）。U显著抑制与氧化还原、细胞分裂、和细胞周期、有关基因的表达，可能是抑制蚕豆根茎生长发育的原因之一（图6B）。

图6 | 转录组分析

KEGG富集途径表明，DEG主要富集于主要代谢途径中，例如碳水化合物代谢、能量代谢、脂质代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢（图6C）。在与碳水化合物代谢有关的其他途径中，功能性基因的表达被U诱导显著抑制（表1）。

表1 |蚕豆根碳水化合物代谢途径中差异基因的鉴定（Log₂FC> 5或Log₂FC <-5）

6.铀对光合作用和呼吸作用的毒理机制

铀显著抑制了光反应性电子传输链路径中相关基因的表达（图7A）。Calvin循环途径中各种关键酶基因被显著抑制（图7B），例如转酮醇酶基因、醛缩酶基因和磷酸三糖异构酶基因。U也显著抑制了与光呼吸路径有关基因的表达（图7C）。同时，铀还抑制了细胞呼吸的氧化磷酸化途径中电子传输链相关基因的表达（例如细胞色素c，解偶联蛋白和F1-ATPase基因）（图7D）。

图7 | 使用Mapman软件对铀影响光合代谢和线粒体电子传输链的可视化分析

作者使用经过改进的霍格兰营养液（无磷）研究了植物在植物的最佳pH（5.5）下对各种浓度的U的毒性反应，避免了由于溶液铀离子（UO₂ ²⁺）沉淀而导致U植物毒性阈值变大。在该条件下，当U暴露浓度为525μM时，蚕豆幼苗的U毒症状明显（图1和图2）。U容易与PO₄ ^3-和CO₃ ^2-结合形成不溶物，并在根部积累，表明U可能主要通过细胞外途径存储在细胞间隙中。本研究发现随着U积累，根中的磷含量显著降低（图3I），表明UO₂ ²⁺与磷酸盐结合并在根中被收集。

有研究表明，重金属直接导致植物水代谢、光合代谢、呼吸代谢、碳水化合物代谢、氮代谢、核酸代谢和植物激素代谢的失衡，从而导致植物生长发育受到抑制。在本研究中发现U显著抑制了蚕豆幼苗的光合速率、气孔导度和蒸腾速率（图3A-C）。结合转录组数据的结果，作者揭示了铀对植物光合代谢的毒性机理：①在光反应中，铀显著抑制叶绿体类囊体膜中的水光解、电子转运链和ATP合成基因的表达（图7A），导致类囊体膜中的电子传输链被阻断并抑制了ATP的形成；②在黑暗反应（卡尔文循环）中，许多基因也被显著抑制（图7B），减少了植物的碳固定，导致光合速率和葡萄糖前体3-磷酸甘油醛含量降低。作者还发现U显著抑制了与光呼吸通路相关的基因的表达（图7C），这导致质子[H]和ATP在叶绿体中过度积累并破坏叶绿体结构。

在植物中，叶片经光合作用产生的碳水化合物通过韧皮部转运至根细胞，并用于根细胞的呼吸代谢。在这项研究作者发现，U导致可溶性糖含量显著降低（图3G）。通过GC-MS非靶向代谢组学确定的参与碳水化合物代谢途径的多种DEM，参与了细胞的糖酵解/糖异生途径、三羧酸循环和氧化磷酸化代谢途径（图4和5），它们是细胞能量供应的关键途径。铀抑制根细胞的呼吸速率（图3 H）的毒理机制是：①在代谢水平上，U导致能量相关代谢物表达失衡；②在转录水平上，U显著抑制与糖酵解/糖生成途径、三羧酸循环途径有关的基因的表达（表1）。特别是在氧化磷酸化途径、，U显著抑制线粒体电子传输链中的细胞色素c基因，解偶联蛋白和F1-ATPase基因（图7D），是细胞呼吸率减少的直接原因。

总之，蚕豆中光合代谢和呼吸代谢对铀毒性的响应机制如图8所示。首先，U显著抑制了光反应性电子转运链、卡尔文循环和光呼吸途径中相关基因的表达，导致光合速率的降低。然后，葡萄糖和其他单糖（果糖半乳糖和塔格糖）、二糖（蔗糖）和三糖（麦芽三糖）的含量发生了显著变化。最后，U毒性显著抑制细胞能量代谢途径（例如糖酵解、TCA循环和氧化磷酸化途径）中相关基因的表达。其中U抑制线粒体氧化磷酸化途径中电子传递链基因的表达，从而导致细胞能量供应异常和根系呼吸速率降低。

本研究发现植物铀积累导致蚕豆幼苗根系死亡、光合碳代谢异常和呼吸代谢异常，其毒理机理如下：

①铀显著抑制光反应性电子转运链，卡尔文循环和光呼吸途径中相关基因的表达，导致光合速率降低；

②铀毒性导致植物细胞能量代谢途径中相关代谢物表达的失衡，也显著抑制细胞能量代谢途径（例如糖酵解、TCA循环和氧化磷酸化途径）中相关基因的表达模式。铀抑制线粒体氧化磷酸化途径中电子传递链基因的表达，从而导致细胞能量供应异常和根系呼吸速率降低。

重金属毒性是植物抗逆性研究的一个重要方向，以往研究方向多集中于植物对铀毒性的生理反应，而基于多层组学的毒性反应机制研究较少。本文是西南科技大学罗学刚团队发表的关于铀毒性机制研究的第二篇文章，作者虽使用了同一组转录和代谢数据，但本文中蚕豆幼苗对铀毒性的响应机制研究更加深入，并与生理表型检测结果相互对应，其严谨的实验思路和深入地研究结果，值得借鉴和参考。

部分参考文献：

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2.Albalasmeh, A.A., Berhe, A.A., Ghezzehei, T.A., 2013. A new method for rapid determination of carbohydrate and total carbon concentrations using UV spectrophotometry. Carbohydr. Polym. 97, 253–261.

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5.Berthet, S., Villiers, F., Alban, C., Serre, N.B.C., Martin-Laffon, J., Figuet, S., Boisson, A.-M., Bligny, R., Kuntz, M., Finazzi, G., Ravanel, S., Bourguignon, J., 2018. Arabidopsis thaliana plants challenged with uranium reveal new insights into iron and phosphate homeostasis. NEW Phytol. 217, 657–670.

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嫣然  撰文

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